流式細胞儀檢測全血的人淋巴細胞

基本方案

材 料（打 V 項 目 見 附 錄 1)

全血，通 常 用 E D T A 抗凝

P B S ，有 或 無 0.1% (m /V ) 疊氮鈉，過濾除菌

單 克 隆 抗 體（標記的，未標記的或生物素化的），通過滴定確定最佳工作濃度

間 標 二 抗（僅用于未標記的一抗）

F T T C 標記的鏈霉親和素或 P E 標記的鏈霉親和素（僅用于生物素化的一抗）

裂解液：如低滲平衡鹽溶液，去離子水， A C K 裂 解 液（附 錄 1)，或商品化的裂解液（如 FACs-Iyse， Becton-Dickinson； Immuno-lyse, Coulter； Whole BloodLyse and Fix reagent, Gen Trak)

1 % (m /V ) 多聚甲醛， p H 7.4

12m m X 75m m 圓 底 離 心 管（Falcon)

Beckman 帶 有 JS-4. 2 轉子的 J-6M 冷 凍 離 心 機（或替代離心機）

1 . 采集患者的全血，對正在用單抗處理的或用單抗治療后體內已經產生人抗鼠的抗體(H A M A ) 的患者，每 100ul 全血加入 3 ml P B S 洗滌。

2 . 當全血來源于白細胞增多患者時 O 15X 106 個白細胞/ml) ，應 用 P B S 稀釋至約 8 XIO⁶ 個細胞/m l 。

3 . 在 1 2m m X 7 5 m m 離心管中加入 IOOpil 全 血 及 適 量 的 單 抗（5 ? 2 0ul) 。 選用以下任一方法標記細胞：

a. 用一種或兩種熒光標記的抗體進行直接法標記。

b. 用未標記的一抗和熒光標記的二抗進行間接法標記。

c. 用生物素化的一抗和 F T T C 或 P E 標記的鏈霉親和素進行間接法標記。

對 照 的 設 置 包 括 ： 未 標 記 的 細 胞 、 同 型 抗 體 對 照 和 熒 光 標 記 的 無 關 抗 體 對 照(間 接 法 標 記 時）。

4 . 裂解液裂解紅細胞（R B C ) (單 元 & 2 , 輔 助 方 案 1，商品化的裂解液參考說明書）。加 入 3?4m l 含 有 0 . 1 % 疊 氮 鈉 的 P B S 。 300 g 離 心 8 min。小心地吸棄上清，再洗滌兩次。加 入 0.1 ml 1 % 多 聚 甲 醛（p H 7. 4)。

5 . 固定細胞。 4°C 避 光 待 檢（< 1 周）。流式檢測前加入 0.6?1. O m l 無菌 的 P B S 。

6 . 設定前向角散射和側向角散射參數以分別了解細胞的大小和物理特性（圖 8.7.側向角散射最好選用對數坐標（當然，也可使用線性坐標）。

7 . 通 過 設 門 技 術 可 以 用 熒 光 標 記 的 抗 體 識 別 單 核 細 胞（C D 1 4 + ) 和 所 有 白 細 胞