淺談原代細胞培養那些事（二）

四、原代細胞培養流程（例：乳鼠肺組織）

1.取材：將1-3天新生乳鼠尾巴提起，整個身體浸入裝有75%酒精的燒杯中3秒左右（默數5下），取出放置到滅菌的培養皿中，移入工作臺內。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大頭針分別固定頭、尾和四肢。用碘酒、75%酒精消毒胸廓部位皮膚。在胸廓正中線中位處，用兩把眼科彎鑷夾起皮膚（多夾些），向左右兩側撕拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，皮膚外翻固定，軀干部肌肉暴露（注意：不要使表皮面接觸到已暴露出來的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，沿著隔膜剪斷胸廓，并將胸骨兩側肋骨剪斷。胸廓暴露后，可見跳動的心臟和粉紅色的肺。將眼科鑷彎頭端向下，從心臟右上方位插入心肺連接處，輕輕向上用力，將心肺一起取出，用鑷子去除心臟，肺移入已加Hanks也的青霉素瓶內。

2.漂洗：用Hanks液漂洗肺臟表面血污，然后粗剪幾下，再用Hanks液漂洗多次后，吸去多余液體。

3.剪切：組織小塊置青霉素瓶一角，用眼科直剪反復剪切組織塊成1立方毫米大小，此過程需20~30分鐘。

4.消化：消化條件的選擇和組織塊大小、組織的硬度、消化酶濃度和種類、實驗溫度、pH值等有關。消化酶濃度范圍為0.25%~0.5%，pH為7.4~8.0，所使用消化液量是被消化物的5~10倍。可通過預實驗，確定jia消化條件。

5.制備單細胞懸液

?離心管的外壁和管口處經酒精消毒，然后移入超凈臺內，管口火焰消毒，Hanks液加至10ml(稀釋酶濃度，停止消化）

?用吸管頭反復輕輕吹打松散組織，當其能順利地通過吸管口時，消化較合適，懸液中有較多分散的單細胞和小細胞團。

?離心管直立靜置片刻，少量未消化的組織塊自然沉降（可加消化液再消化）。將細胞混懸液移至離心管中，補加Hanks液至10ml，混勻后離心（速度、時間同上）。

科研中常用篩網法去除細胞混懸液中的細胞團，收集過篩網的單細胞懸液。

?去上清液后加2ml細胞培養液，細胞混勻計數，調整細胞濃度為5.0×105/ml。

6.接種：在培養瓶的側面做好標記，培養物的名稱、組號和日期。接種時，在25ml培養瓶中先加入1.5ml培養液，再接種1ml細胞懸液，用吸管輕輕混勻細胞后加蓋瓶塞。持瓶作上下、左右十字形水平晃動后，移入37℃、5%CO2培養箱中培養。

五、原代細胞操作要領

1.原代細胞混勻操作要領

?火焰消毒吸管，用Hanks液冷卻和濕潤管內壁（這是因為剛分離的組織細胞易粘在管壁上）。

?吸管頭插入管底。

?用吸管反復輕輕吹打組織塊。

2.器械的使用操作要領

?用工作臺消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械

?器械置無菌干紗布內擦一下，迅速通過火焰，冷卻后使用

?用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒

?器械按浸泡消毒的順序使用

?各套再消毒器械不可混用

3.除去組織塊多余水分的操作要領

用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向對側的多余水分。

注意：多余水分若不除去，會使組織塊剪切不細，消化后的細胞懸液清亮（細胞數少），并可見消化液中有線狀或絮狀物漂浮。

4.細胞計數操作要領

?用吸管混勻待計數的細胞懸液

?將一小滴細胞懸液從蓋玻片與載玻片交接部位滴入細胞計數池中

?沉降1分鐘，低倍鏡下計數血球計數板四大中格中的結構完整的細胞，小細胞團計數為1

?計數時，如果細胞壓在格上，則數上不數下，數左不數右。然后按下式計算出每毫升懸液中的細胞數。

（四大中格細胞數/4）×10000=細胞數/毫升

注：細胞計數板上，每一中格體積為0.1立方毫米

六、原代培養注意事項

?細胞生長密度不高時，不能急于傳代培養

?原代培養的貼壁細胞需控制消化時間

?吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形

成，以盡可能減少對細胞的機械損傷

?*傳代細胞接種數量應多一點，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸

液有組織塊，也一并傳入到培養瓶，盡量減少細胞損失。

?*傳代細胞培養pH偏低些

?胎牛血清濃度可加大至15%-20%

?加入的培養液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來

七、如何提高原代細胞培養的成功率？

?在選擇材料的時候一定要注意選取比較健康的小鼠。在處理胚胎的時候要干凈利落。不要把胳膊等部位的細胞混進去了。

?操作一定要無菌，不能污染。在剪碎細胞的時候，一定要注意盡量剪得碎一點。

?運用消化法時胰酶溫度應小于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。

?如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養液接觸。翻轉培養瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。

?取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，如手術刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。

八、原代細胞培養的胎牛血清推薦

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