1. 編號：取無菌平皿9套，分別用記號筆標明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有4.5 ml 無菌水的試管，排列于試管架上，依次標明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2. 稀釋：用1 ml 無菌吸管精確地吸取0.5 ml 大腸桿菌懸液放入10-1的試管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出時，管內液體外溢。然后仍用此吸管將管內懸液來回吸吹三次，吸時伸入管底，吹時離開水面，使其混合均勻。另取一支吸管自10-1試管吸0.5 ml 放入10-2試管中，吸吹三次，其余依次類推。
3. 取樣：用3支1 ml 無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液0.2 ml，對號放入編好號的無菌培養皿中。
4. 倒平板：于上述盛有不同稀釋度菌液的培養皿中，倒入溶化后冷卻至45℃左右的肉膏蛋白胨瓊脂培養基約10~15 ml，置水平位置，迅速旋動混勻，待凝固后，倒置于37℃溫室中培養。
5. 計數：培養24小時后，取出培養皿，算出同一稀釋度三個平皿上的菌落平均數，并按下列公式進行計算：
每毫升中總活菌數=同一稀釋度三次重復的菌落平均數×稀釋倍數×5
一般選擇每個平板上長有30~300個菌落的稀釋度計算每毫升的菌數最為合適。同一稀釋度的三個重復的菌數不能相差很懸殊。由10-4、10-5、10-6三個稀釋度計算出的每毫升菌液中總活菌數也不能相差懸殊，如相差較大，表示試驗不精確。
平板菌落計數法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的，一般以三個稀釋度中的第二稀釋度倒平板所出現的平均菌落數在50個左右為最好。
平板菌蓓計數法的操作除上述的以外，還可用涂布平板的方法進行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基溶化后倒平板，待凝固后編號，并于37℃溫室中烘烤30分鐘左右，使其干燥，然后用無菌吸管吸取0.2 ml 菌液對號接種于不同稀釋度編號的培養皿中的培養基上，再用無菌玻璃刮棒將菌液在平板上涂布均勻，平放于實驗臺上20~30分鐘，使菌液滲透入培養基內，然后再倒置于37℃的溫室中培養。
6. 結果 將計數結果填入下表。 
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