實驗材料 λgtll 重組噬菌體大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株
試劑、試劑盒 細胞裂解液IPTGMgS04?7 H20苯甲基磺酰氯SMLB 培養液
儀器、耗材 SorvallSS-34 轉子或同等產品沸水水浴液氮
實驗步驟
材料
緩沖液劑及溶液
貯存液，緩沖液及試劑的組分見附錄 1。
將貯存液稀釋至合適濃度。
細胞裂解液（每個分析的噬斑需 100ul)
50 mmol/L Tris-Cl (pH6.8)
100 mmol/L 二硫蘇糖酵
2%(m/V)SDS
0.1%(m/V) 溴酚藍
10%(V/V) 甘油
IPTG(1mol/L)(每個分析的噬斑需 70ul)
MgS04?7 H20(1mol/L)
苯甲基磺酰氯（PMSF)(100 mmol/L)
SM
用完后棄掉以防污染。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠
請見步驟 12。
培養液
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養液
離心機及轉子
SorvallSS-34 轉子或同等產品
專用設備
沸水水浴
液氮
載體及細菌菌株
λgtll 重組噬菌體
制備λ重組噬菌體貯存液：單個噬斑放入約 1mlSM 中室溫放置 2 h 成通過制備平板裂解液來制備（見第 2 章方案 3)。
大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株
此菌株可通過 ATCC(www.atcc.ors) 獲得，關于大腸桿菌 Y1090 菌株有關信息，見本章信息欄中質粒及λ噬菌體表達載體相關內容。
方法
1. 取大腸桿菌 Y1090 hsdR 菌株單個菌落接種到 50 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 培養液中，37°C 過夜培養，并不斷溫和振蕩（搖床 250r/min)。
2. 將培養液轉移至離心管中，室溫下 4000 g(SarvallSS-34 型轉子 58OOr/min) 離心10min。
3. 棄上清，用 25 ml10mmol/LMgS04 重懸細胞，使用前將細菌懸液置于冰上保存。
4. 在 15 ml 無菌管中，將 8 ml 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB，400ul 細菌懸液及 100ul 噬菌體裂解液混合。
因為融合蛋白質是從感染細胞本身分離的而非裂解液（見方案 8), 因此有必要獲得目的λ噬菌體的高產量感染同時避免培養物的過早溶菌現象。由此. 在操作過程中，常使用低感染復數（毎 16000 細胞約 1 pfu)。
5. 將管放于 37°C 水浴中振蕩 2 h。
6. 每份培養物取 lml 到無菌微量離心管中，蓋緊管蓋，存于液氮中。向剩余感染的培養物中加 70ul 1mol/LIPTG,37°C 繼續培養。
7. 每隔 1 h, 每份感染的細胞培養物取 1 ml 轉到微離心管中，蓋緊管蓋，存于液氮中。通過此方式，收集 4 h 內的小份培養液。
8. 剩余的感染培養物 37°C 繼續溫育 12 h, 從每份培養物中最后一次取 lml 樣品，蓋緊管蓋，液氮中放 30 min。
9. 融化所有樣品，于室溫最大速度離心 1 min, 收集感染的細菌，去掉細菌培養液。
10. 每管中加 100ul 裂解緩沖液，強烈渦旋迅速重懸細胞。
11. 將樣品放入沸水中 3 min, 轉到室溫加 1ul 100 mmol/LPMSF, 振蕩混勻。
12. 用 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳與免疫印跡直接分析樣品。電泳前，樣品在微離心機中最大轉速 1 min, 取 25 上清液加到 SDS-聚丙烯凝膠上或放到-70°C 保存直至使用。
用 IPTG 處理培養物后目的融合蛋白的量在 1~4 h 內是逐步增高的。此后，蛋白質的量雖可能增加，可能保持不變，也可能因感染的細胞裂解釋放蛋白質到培養物中而降低。