液態活檢的“當家花旦”：cfDNA和CTC

液態活檢（liquid biopsy）已經成為臨床腫瘤學的一門“顯學”，其學術意義和臨床應用前景也越來越明朗。液態活檢按照檢測對象分類，主要可以分為核酸層面的ctDNA和細胞層面的循環腫瘤細胞（CTC）。

??胰腺導管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是一種惡性腫瘤，患者被確診時往往已處于晚期，甚至病灶已經轉移。臨床上可通過手術切除進行治療的病人約為15~20%，早期PDAC患者的五年生存率僅為5%左右。目前雖然五年生存率已經提高到27%，但80%的病人仍然面臨著治療后的復發。

??目前臨床上廣泛采用的PDAC腫瘤標志物是CA19–9，其檢測靈敏度是79%，特異性是82%。但CA19-9還不是最理想的檢測標志物，例如在急性胰腺炎等狀況下CA19-9也會升高。本研究中，西班牙科學家以臨床上確診的PDAC病人為研究對象，對其外周血中的總cfDNA、腫瘤特異的ctDNA和CTC分別進行了分析，并將結果與患者總生存期（overall survival, OS）之間的相關性進行了分析。
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??共有45名PDAC患者參與了此次研究，入組時間為2009年10月至2014年5月。根據病人免疫組化的結果，將病人分為三個級別：可手術切除患者、未轉移晚期患者、轉移患者。31名病人進行了cfDNA和KRAS突變含量的檢測；35名病人進行了CTC的檢測。其中21名病人同時進行了cfDNA和CTC的分析，7名病人在檢測前接受了gemcitabine治療。

??患者血漿中cfDNA的總含量

??31名患者血漿中純化得到DNA，對RNaseP基因進行定量檢測，以RNaseP的含量作為血漿中cfDNA總含量的指標（RNaseP的含量通過微滴式數字PCR分析得到）。在20ul血漿中RNaseP總含量的平均值為93個拷貝（范圍：6~1,663）。分析顯示病人血漿中cfDNA總含量隨著腫瘤的發展而升高，但兩者間并沒有統計學意義上的相關性，和患者的總生存期也不存在相關性。具體結果見下圖。
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??血漿中腫瘤特異性ctDNA（KRAS突變）的檢測

??根據COSMIC數據庫，本研究對血漿中PDAC相關的ctDNA以KRAS突變為檢測對象，檢測的突變位點分別是：G12D，G12R和G12V，檢測直接采用了Bio-Rad公司的PrimePCR KRAS檢測試劑盒。選擇這三個位點作為檢測對象的原因是G12D，G12R和G12V分別占到PDAC原發腫瘤突變的51 %, 29 %和12 %。
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? 實驗前分別對三個位點檢測試劑盒的特異性進行了測試。其中G12D和G12R試劑盒之間不存在非特異的檢測結果，而G12V試劑盒會產生G12D非特異性的檢出。所以本研究中，每個樣品對應的突變陽性微滴在3個以上才被判定為陽性。

??對患者樣品檢測前，將含有G12D突變的胰腺癌細胞系SUIT-2以250ng，100ng，50ng 和25ng DNA的含量加入正常人1ml的血漿中，純化后利用PrimePCR KRAS G12D ddPCR檢測試劑盒進行檢測。結果顯示在模擬條件下，ddPCR的實測結果與理論值的correlation coefficient為0.99（p<0.01）。檢測下限為0.5ng SUIT-2細胞系DNA（相當于37個G12D突變分子）。

??對31名患者血漿中KRAS突變位點的分析結果如下：其中8名患者的血漿中含有KRAS突變，檢出率為26%。其中G12D突變的為6人，G12R和G12V的病人各1人。3名為可通過手術治療，1名為未轉移晚期，4名為轉移患者。由于PDAC還有其他低頻的KRAS突變位點，因此本研究中26%的檢出率有可能被低估。3名可通過手術治療的病人中檢出KRAS突變意味著在還未發生病灶轉移及釋放CTC進入血液循環的情況下，就可檢測到ctDNA。

??KRAS突變位點檢測呈陽性患者血漿中cfDNA的含量顯著高于陰性患者。KRAS檢測陽性患者的總生存期顯著短于陰性患者，前者為60天，后者為772天（p = 0.001）。分析結果見下圖。
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??PDAC原發病灶中KRAS突變位點的檢測

??上述31名患者中的12名取得了原發灶的組織塊，提取DNA后進行了毛細管電泳測序。測序結果表明：5名血漿中KRAS檢測呈陽性的病人，其中3名在原發灶組織中也檢測到了相同的突變，另外2名組織塊的測序結果顯示為陰性。

??上述血漿檢測和原發灶測序結果的比較意義有二：首先，由于胰腺癌病灶一般通過超聲內腔鏡下細針抽吸活檢術（endoscopic ultrasound-guided fine-needle aspiration，EUS-FNA）獲得，因此并非每個病人都能獲得原發病灶組織，所以血液的ctDNA檢測能作為一種無創檢測的方式了解腫瘤（相關閱讀請直接回復數字“006”）；其次，即使獲得了病灶組織，不可避免其中會混有來自諸如基質組織等的大量正常細胞，由于毛細管測序的靈敏度限制往往會造成漏檢。

??PDAC患者中的CTC分析

??對35名PDAC患者CTC的分析結果如下：其中7名患者檢測到CTC，檢出率為20%。其中1名為可通過手術治療，6名為轉移患者。前者僅檢測到1個CTC，后者分別檢測到1~13個CTC。

??CTC檢測呈陽性患者的總生存期顯著短于陰性患者，前者為88天，后者為393天（p = 0.0108）。分析結果見下圖。
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??相比于其他實體瘤，PDAC患者中CTC的檢出率是較低的。例如結直腸癌病人中，同樣采用強生公司CellSearch系統，CTC的檢出率為36%。另一方面，測得的CTC個數PDAC也少于其他腫瘤。如本研究中PDAC患者中測得的CTC數為1~13個，相比于前列腺癌和乳腺癌，約57%和25%的病人能夠檢測出至少5個CTC。

??在PDAC患者中CTC低檢出率的另一個原因是CellSearch系統的檢測方法。CellSearch系統是根據EpCAM和CK來識別CTC的，最近一項小鼠模型的研究表明PDAC腫瘤細胞中僅有27%表達EpCAM，約有40%的細胞表達間質分子標志物Zeb1。這說明對處于上皮-間質轉化（epithelial to mesenchymal transition, EMT）的CTC而言，由于其低表達水平的EpCAM和CK，也許需要其他的CTC檢測方式。

??ctDNA與CTC分析結果的一致性

??21名同時有ctDNA和CTC檢測數據的患者，其中5名CTC檢測為陽性的患者中4名檢測到了KRAS突變的ctDNA，其中1名ctDNA檢測為陽性的患者CTC結果呈陰性。總體上，ctDNA和CTC分析具有一致性。

??化療對ctDNA檢測的影響

??1.  7名病人在檢測前接受了gemcitabine治療，其中僅一名患者的ctDNA檢測呈KRAS突變陽性，其余均為陰性。

??2.  4例原發灶組織通過測序檢測為KRAS突變陽性，其中僅1例的血漿中ctDNA檢測也呈陽性，其余3例血漿檢測為陰性，這3例患者在血液檢測前都接受了gemcitabine治療。

??總結

??1.  對于PDAC，ctDNA是腫瘤早期檢測和預后評估的有效分子標志物。

??2.  cfDNA總含量有望成為腫瘤分期的參考指標，但需更大規模的群體研究。

??3.  CellSearch系統對PDAC患者CTC的檢出率較低，對病灶轉移的晚期患者更有效，這種情況下對臨床治療的幫助不大。

??4.  對于PDAC患者的CTC檢測，需要依賴于更多的細胞標志物。