液相法篩選cDNA表達文庫中RNA結合蛋白實驗

實驗方法原理 將 cDNA 文庫表達的蛋白固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后用標記的 RNA 對其進行篩選的方法是篩選 RNA 結合蛋白研究中最常用的技術。

實驗材料 TY

試劑、試劑盒 儲存液溶菌酶干粉細菌裂解緩沖液甘油水溶液

實驗步驟

一、材料與設備

1. 2X TY：16 g 蛋白胨，10 g 酵母提取物，5 g NaCl，水定容至 1 L，高壓滅菌。

2. 儲存液：1 mol/L IPTG；1 mol/L DTT；100 mmol/L PMSF( 用無水異丙醇配制）；均分裝后 -20℃ 保存。

3. 溶菌酶干粉，-20℃ 保存。

4. 細菌裂解緩沖液：150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA，1% NP-40（或 Igepal-630），4℃ 保存。用前取 10 ml 置于冰浴，加 10 μl 1 mol/L DTT、100 μl 100 mmol/L PMSF 和約 20 mg 溶菌酶。

5. 40% 甘油水溶液，高壓滅菌后 4℃ 保存。

二、操作方法

1. 將質粒 cDNA 表達文庫轉化到大腸桿菌，在含抗生素的培養液中 37℃ 振搖培養直至 OD600 達 0.5~1.0，4℃ 保存培養產物。臨用前取出一部分逐級稀釋后涂板，計克隆數并計算文庫滴度。

2. 在培養管內加 2 ml 含抗生素的 2X TY，每管接種 250 個細菌克隆，37℃ 振搖培養直至 OD600 達 0.5。

3. 10 mmol/L IFTG 誘導表達 lacZ 融合蛋白，37℃ 振搖培養 3 h 或過夜。

4. 將培養物標號，取 1.5 ml 14000 g 室溫離心 1 min 收集，其余 0.5 ml 于 4°C 保存。

5. 將離心獲取的細菌置于冰上，用細菌裂解緩沖液重懸，冰浴 30 min。

6. 14000 g，4℃ 離心 15 min。同時取干凈離心管置于冰浴，標好號后各加 20 μl 40% 甘油；將離心后的樣品管同樣置于冰浴，從中取 20 μl 上清加入含甘油的干凈的離心管內，吹打混勻，即獲得含有 cDNA 文庫蛋白的細菌提取物。

7. 將細菌提取物立即用干冰/乙醇或液氮速凍，-70°C 保存。（用時冰浴化開，再保存時同樣先用干冰/乙醇或液氮速凍再置于 -70℃。）

8. 用結合位點探針對提取物進行檢測（gel-shift 或 UV 交聯法）。如果收集的提取物中有 RNA 結合活性，再用陰性對照探針和所研究的 RNA 探針共同檢測此 RNA 結合活性的特異性。

9. 對于提取物中具有 RNA 結合活性的樣品，根據標號找到對應的、保存于的其余 0.5 ml 細菌培養產物，計數樣品滴度；接種 40 個培養管，每管 25 個細菌克隆，37℃ 振搖培養直至 OD600 達 0.5。

10. 重復步驟 (3)~(9)。一旦某一管中的細菌蛋白提取物被證明具有 RNA 結合活性，就將對應標號細菌培養樣品涂板以獲取單一克隆，再接種 20 個培養管，每管 5 個克隆細菌；重復步驟 (3)~(9)；最后一輪篩選，接種 20 個培養管，每管僅含 1 個克隆。