流動相是影響液相色譜的關鍵因素。一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機溶劑或它們的混合液，但是如何配制。選擇配制的方法不同，分析結果特別是保留時間，是會有顯著差別的。
高效液相色譜法中的流動相主要用水性溶劑、有機溶劑或它們的混合液，水性溶劑也常用于緩沖液。常因資料上表示的內容和實際的配制方法不同，而產生流動相的差異，影響了色譜圖和分析結果。
一般來說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進行。溶液的體積因溫度而變化，所以按重量比混合可調制再現性較好的混合溶劑，但由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。只要沒有特別標明，就可按體積比進行混合，但在特殊情況下，如胺類粘度高的溶液混合時，有時用重量—體積比（W/V）的方法。
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a.流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。流動相溶解度達不到要求時，盡量選用流動相中含有的比例較大的成分，以減輕進樣對流動相的影響造成基線不穩。 21項注意讓你更懂液相流動相 流動相受熱，或者流動相不同組分混合時會有氣體產生，氣泡進入泵內引起壓力波動，增加噪音，色譜圖上出現毛刺。 可試用下列方法解決問題：流動相再脫氣；采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；改系統內混合為系統外預混合。HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在系統內逸出氣泡，影響泵的工作。