液相色譜壓力和基線問題全面大解析

　　小伙伴們用液相做實驗的時候是不是總會遇到各種壓力問題和基線問題，比如高了，低了，堵了，漏了，飄了等等。今天一起來看看導致這些問題的原因吧，從根源上突破~

　　液相色譜壓力異常

　　液相系統壓力產生的原因在于流動相流經管路及色譜柱時會有阻力，即所謂的反壓或系統壓力。漏液會引起系統壓力的降低，而堵塞會引起系統壓力的飆升。系統壓力的單位有：巴（Bar）、兆帕（Mpa）和磅／平方英吋（psi），它們之間的換算關系為1Bar＝0.1Mpa＝14.5psi。

　　1、影響因素

　　影響系統壓力的因素主要有流動相的溶劑組成、溫度及流速這三方面：

　　1）流動相的粘度是產生反壓的主要原因，下圖為有機溶劑-水的粘度隨組成與壓力的關系圖：

　　由上圖可以看到，乙腈-水比例為（20:80）、甲醇-水比例為（40:60至50:50）時，系統的壓力最大。因此，在做實驗時應盡量避開這個比例范圍。另外，異丙醇粘度大，一般不作流動相使用。

　　2）流速對反壓的影響是線性關系，流速增加，反壓亦增大。

　　3）溫度對反壓的影響是反比關系，溫度升高，反壓降低，對某些流動相的影響更大一些。

　　4）液相色譜儀各模塊之間的連接管路也會產生壓力，系統壓力與管路的長度成正比，與管路直徑的四次方成反比（1/4D）。上述考慮的是柱外因素對系統壓力的影響，色譜柱對系統壓力的影響也很大，反壓與色譜柱長度成正比，與填料顆粒度的平方成反比（2.5μｍ填料比3.5μｍ填料反壓高）。

　　2、壓力原因

　　具體到壓力問題的表現形式上，主要有壓力高、壓力低或沒有壓力以及壓力不穩：

　　①造成壓力高問題的主要原因有：

　　1）溫度太低；

　　2）流速太高；

　　3）流動相粘度大；

　　4）管路堵塞；

　　5）儀器或色譜柱堵塞；

　　6）壓力傳感器問題。

　　②產生壓力低情況的可能原因：

　　1）系統內有滲漏處；

　　2）單向閥堵塞；

　　3）入口管路有氣泡；

　　4）溶劑濾頭堵塞；

　　5）所用溶劑不正確，儲液瓶中無溶劑；

　　6）溫度太高，流速太低；

　　7）泵未輸送流動相；

　　8）泵關閉或保險絲斷了。圖片

　　以上為儀器單向閥的結構示意圖，如果某些原因造成寶石球與球基座發生黏結，造成液體不能進入到泵中，從而造成泵的壓力偏低。

　　3、造成壓力波動可能的原因有：

　　1）脫氣機排氣不充分；

　　2）流動相未正確脫氣；

　　3）所用溶劑不混溶或易揮發；

　　4）壓力傳感器及泵問題。

　　基線噪音為題

　　1、基線噪音大

　　1）流動相中有氣體：溶劑脫氣；

　　2）流動池中有氣泡：在出口處使用0.009”的管路；

　　3）色譜柱上的污染物被洗脫：平衡系統，直至基線穩定；如樣品中有保留非常強的組分，可設置強洗脫程序；

　　4）滲漏：此時應修復滲漏，重新連接或更換接頭；

　　5）檢測器燈能量低：更換燈；

　　6）靈敏度太高：使用合適的采樣頻率，調節增益（如ELSD檢測器）；

　　7）檢測器流動池臟：清潔流動池；

　　8）電噪音：除去電噪音的來源：屏蔽電纜，清潔觸點；

　　9）采樣頻率設置過大：一味追求高采樣頻率，可能對靈敏度沒有任何幫助，同時也會產生比較大的噪音：UV檢測器推薦降低采樣頻率，HPLC推薦1-5Hz，UPLC推薦20Hz。

　　2、同步的基線噪音

　　1）大多數情況下都是泵引起的，泵頭中存在空氣：將溶劑脫氣，并重新灌注泵；

　　2）單向閥問題：超聲清洗單向閥或更換；

　　3）柱塞桿斷裂：更換；

　　4）混合問題：更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積；

　　5）電噪音：改變電路，除去來源。

　　3、不同步的基線噪音

　　1）氣泡：流動相要脫氣；

　　2）檢測器中有氣泡/空氣：流動相脫氣，或在檢測器的后面加反壓（不適用于RI檢測器）；

　　3）滲漏：特別是肉眼無法發現的微漏或者泵的內漏，會造成流速的變化和混合比例的變化，從而導致基線噪音，此時應修復滲漏，重新連接或更換接頭；

　　4）管路堵塞：除去堵塞，沖洗系統；

　　5）電噪音：除去來源，改變電路。

　　4、基線漂移：上漂或者下漂

　　1）梯度變化引起，如溶劑Ｂ的吸收值高于溶劑A：使用基線差減，或嘗試新的流動相；

　　2）化合物從色譜柱上洗脫：平衡系統，直至基線穩定；如樣品中有保留非常強的組分，可設置強洗脫程序；

　　3）溶劑改變（氣體吸附，蒸發）：氦氣脫氣，隔離溶劑；

　　4）溶劑滲漏：擰緊或者更換接頭；

　　5）檢測器溫度影響（尤其是示差，電化學以及電導檢測器）：流動池溫度調節；

　　6）柱溫波動：等待柱溫平穩，使用柱預加熱器；

　　7）壓力變化：過濾溶劑以及樣品，或樣品太粘稠；

　　8）混合問題：更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積。

　　5、Cyclic基線

　　1）溫度影響：隔離熱源，或搬離臨近的通風口，或增加流動池溫度；

　　2）混合問題：更換一個體積更大的Mixer，以增加系統體積；

　　3）流動相中的氣體：溶劑脫氣；

　　4）泵不穩定：檢查維修泵；

　　5）管路堵塞：沖洗系統，排除并除去堵塞源頭；

　　6）電問題：改變電路，或除去根源。

　　6、基線上的毛刺

　　1）氣泡：溶劑脫氣，并重新灌注泵，流動相脫氣越好，基線就會越好；

　　2）信號連接不好，連線變松：清潔并擰緊檢測器上的導線，或檢查連線是否有損壞，或更換鏟形接線片；

　　3）燈繼電器試圖點燃熄滅的燈：更換燈；

　　4）電噪音：更換電路，或除去根源。

　　7、小結

　　1）確保無電源及電噪音干擾；

　　2）為避免基線噪音，確保儀器系統內無氣泡或空氣，流動相首選過濾脫氣；排盡管路、進樣器、檢測池中的氣泡；選擇合適的接頭和管路，防止滲漏；

　　3）在編輯方法時，針對HPLC和UPLC儀器UV檢測器設置合適的采樣頻率，HPLC推薦1-5Hz，UPLC推薦20Hz；

　　4）保持良好的操作習慣，如UPLC儀器水相流動相每天更換，添加了緩沖鹽的流動相過0.2μｍ溶劑過濾膜等，都會減小基線噪音的產生。