液相色譜及液質聯用技術在環境分析中的應用

高效液相色譜(HPLC )是在經典液相色譜的基礎引入氣相色譜理論加以改進和發展起來。經典的液相色譜是歷史最為悠久的色譜技術,氣相色譜相比,它卻經歷了半個世紀坎坷不平的發展道路。20世紀60年代末,經典的液相色譜才發展成高效液相色譜。進入20世紀80、90年代后,高效液相色譜迅速發展,目前已廣泛應用于環境監測、生物化學、石油化工等各個領域之中,并且在監測分析大氣、水質、土壤、生物和食品

等環境樣品方面取得了重要的成果[1]

。

氣相色譜主要分析的特點是通常在高溫下分析,要求樣品必須具有熱穩定性、樣品必須是揮發性的、流動相只用來帶動樣品,不參與分離作用、分析樣品分子量一般小于500amu 、難于回收。而液相色譜的主要分析的特點是可以在常溫下分析、樣品必須溶于流動相、固定相與流動相均參與分配作用、分析樣品無分子量限制、樣品容易回收等。在已知有機化合物中,適用于氣相色譜分析的揮發性化合物約占20%左右,而80%左右的化合物均屬于揮發性低、易受熱分解、離子型化合物或大分子化合物(分子量大于300amu 以上),這些化合物大

部分皆適于高效液相色譜分析。而液相色譜與質譜接口技術的發展,實現了液質聯機,進一步提高了液相色譜分析的靈敏度和定性能力,極大地拓展了高效液相色譜的分析能力和領域。當前高效液相色譜在分離速度、柱效、檢出靈敏度和自動化等方面都達到了與氣相色譜取長補短、互相媲美的程度,兩種色譜分析技術在環境監測等領域中起著相輔相成的作用。

1高效液相色譜及液質聯用技術在環境分析中的應用

在環境監測中,高效液相色譜及液質聯用技術已逐步上升為常用的監測方法。如多環芳烴類、酚類、多氯聯苯、鄰苯二甲酸酯類、陰離子和非離子表面活性劑、有機農藥、除草劑等[2]。

現行的《地表水環境質量標準》(GB /T3838－2002)中有機污染物特定項目68項

,《生活飲用水衛生標準》(GB5749－2006)毒理指標中有機化合物53項,這些有機物指標大都使用氣相色譜及氣質技術測定,少數采用高效液相色譜法測定,如多環芳烴、阿特拉津。隨著社會發展和環保意識的增強,人們對飲用水質量的關注度越來越高,國家也提高了對飲用水源水質中有毒有害化合物的檢測要求。事實上地表水有機污染物指標中有很多組分可開發高效液相色譜及質譜聯用法。

下面就從液相色譜適合分析的特點:分子量大、揮發性低、熱穩定性差、極性較強等幾個方面介紹,結合本實驗室實際工作,有針對性的舉例說明,HPLC結合質譜技術在環境監測中的具體應用。

1.1多環芳烴類(PAHs)

———具有熒光響應,液相色譜法可獲高靈敏度

PAHs是一類由2個或2個以上苯環連接而成的碳氫化合物,包括萘、蒽、菲、芘等150余種,可分為芳香稠環型和芳香非稠環型,許多多環芳烴類具有三致毒性[3]。PAHs的水溶性較差,脂溶性較強,可在生物體內蓄積。

目前氣相色譜/質譜[4－5]和液相色譜[6]是檢測PAH最常用的方法。氣相色譜/質譜具有高選擇性、高分辨率的特性,而且由于多環芳烴的熱穩定性,用質譜作為檢測器時,能夠得到大的分子離子峰和很少的碎片離子,所以用GC－MS測定時定性更加準確。相對于氣相色譜,液相色譜可以更好地測定低揮發性的多環芳烴,并能夠有效分離多環芳烴的同分異構體,采用熒光檢測器時,能夠獲得優于GC－MS的靈敏度。氣相色譜質譜測定檢出限可達μg/L,而高效液相色譜法測定檢出限可達ng/L。我國現行標準HJ478－2009已采用高效液相色譜－紫外檢測器－熒光檢測器檢測水和廢水中多環芳烴類污染物。

1.2氨基甲酸酯類農藥

———存在熱降解問題

氨基甲酸酯類農藥是20世紀50年代發展起來的有機合成殺蟲劑,是繼有機磷農藥后發展較為迅速的新型殺蟲劑和除草劑。其中甲萘威、呋喃丹為地表水80項指標。氨基甲酸酯類農藥部分品種熱穩定性差,多數品種紫外吸收和熒光吸收差。鑒于這些特性,該類農藥在氣相色譜分析及液相色譜分析中均存在一定的問題。

目前應用于氨基甲酸酯農藥殘留檢測的方法分為化學法和生物法兩大類。生物法包括活體生物測定法[7]、乙酰膽堿酯酶抑制法[8]、酶聯免疫法[9]等,簡單快速,易操作,但氨基甲酸酯類農藥都具有膽堿酯酶抑制作用,特異性較差,檢測的物質和農藥品種有限。色譜法多采用高效液相色譜法[10]、液質聯用技術[11]或氣相色譜[12]、氣質聯用技術測定[13]。氣相色譜法和氣質聯用技術由于部分氨基甲酸酯類農藥的熱穩定性較差,采用這兩種方法測定會造成分解,如涕滅威,甲萘威等,造成測定不準確,因此液相色譜比氣相色譜更適合于氨基甲酸酯類農藥的分析。液相色譜柱后衍生熒光法應用最廣泛,EPA8318、EPA531等方法均采用液相色譜柱后衍生法測定該類化合物,該法靈敏度最高。而采用液質聯用技術無需對其進行衍生化,定性也更加準確,尤其適用于復雜基質的痕量分析。

1.3苯胺類、丙烯酰胺、草甘膦

———極性較強化合物

極性較強化合物不適合氣相色譜分析,在毛細管柱上會存在峰形拖尾現象,解決方法可采用衍生化法掩蓋極性基團,但衍生化前處理增加了分析步驟,也增加了分析誤差。這類化合物只要具有紫外或熒光吸收,就可采用液相色譜法進行分析,若不具備紫外或熒光吸收,可考慮采用質譜檢測器進行檢測。

苯胺是重要的化學中間體,用途廣泛。我國將苯胺類化合物列為環境重點污染物,并制定了最高允許排放濃度。同時在集中式生活飲用水地表水源地標準限值也規定了苯胺為0.1mg/L。標準檢驗方法:GB/T5750.8－2006《水和廢水監測分析》第四版液相色譜法。

丙烯酰胺具有致癌性。《地表水環境質量標準》(GB3838－2002)中規定,集中式生活飲用水地表水源地中丙烯酰胺的標準限值為0.5μg/L。《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T5750－2006)及《水源水中丙稀酰胺衛生檢驗標準方法氣相色譜法》(GB11936－89)中均采用氣相色譜法,該方法要求水樣經溴化,乙酸乙酯作為萃取溶劑,電子捕獲檢測器檢測,僅適用于生活飲用水、水源水和比較潔凈的地表水中丙烯酰胺的測定,最低檢出限為0.05μg/L,該方法的存在問題:樣品前處理工作較為復雜、樣品經溴化衍生提取后,干擾較多、無法準確定性、峰型拖尾嚴重。國外的主要分析方法:針對水和廢水樣品的美國EPA Method8032A:氣相色譜－電子捕獲檢測法、美國EPA Method8316直接進樣－高效液相－紫外檢測法、德國DIN38413－6高效液相色譜－串聯四極桿質譜檢測法。

本實驗室采用高效液相色譜－串聯四極桿質譜檢測水體中丙烯酰胺,可直接進樣,檢出限達ng/L,完全滿足國家標準限值要求。標準樣品色譜圖見圖1

。

圖1丙烯酰胺標準品色譜圖(0.4μg/L)

Fig.1LC/MS/MS chromatogram of acrylamide(0.4μg/L)

草甘膦(Glyphosate,PMG)是當今世界上產量最大的除草劑,是除草活性最強的有機磷農藥,能控制危害最大的雜草中的76種,應用十分廣泛。長期大量使用,已對環境造成影響,因此《生活飲用水衛生規范》(GB/T5750.9－2006)中規定其限量為0.7mg/L。

一方面,草甘膦具有強極性、低揮發性的特點,導致其難以氣化,且在常規反相柱上沒有保留,難以利用氣相色譜(GC)和高效液相色譜(HPLC)進行分離測定;另一方面,由于缺少生色基團,難以直接利用紫外和熒光檢測器進行檢測

。

圖2500μg/L草甘磷衍生化反應后高效液相色譜圖

(保留時間6.19min)

Fig.2HPLC chromatogram of Glyphosate derivative

(500μg/L,tＲ=6.19min)

本實驗室采用芴代甲氧基酰氯(FMOC )衍生化試劑對草甘膦進行柱前衍生化,之后采用熒光檢測器進行分析,獲得了較好的色譜保留和儀器響應,見圖2。

1.4微囊藻毒素

—

——大分子量化合物微囊藻毒素(MC )是一類單環七肽物質,一般結構為環D －丙氨酸－L －X －赤－8－甲基－D 異天冬氨酸－L －Y －Adda －D －異谷氨酸－N －甲基脫氫丙氨酸。

MCs 對環境及人類健康的危害已引起世界各國的普遍關

注。1998年世界衛生組織(WHO )出版的《飲用水衛生基準》中

建議飲用水中MCs 標準為1.0μg /L ,英、美等國限定天然水體及飲用水中的MCs 含量為1.0μg /L ,加拿大健康組織認為飲用水中可接受的MCs 標準為0.5μg /L 。中國尚未制定飲用水中MCs 總含量標準,在2001年6月衛生部頒布的《生活飲用水衛生規范》中將MC －LＲ的濃度暫行基準值定為1.0μg /L 。國

家環境保護總局頒布的

《中華人民共和國國家標準》(GB3838－2002)中在集中式生活飲用水地表水源地特定項目標準限值中列出MC －LＲ的標準值同樣為1.0μg /L 。

目前MCs 的檢測技術主要有生物分析法[14]

、細胞毒性檢測法[15]、酶聯免疫吸附法(ELISA )

[16]

、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA )

[17]、高效液相色譜法(HPLC )[18

]、高效液相色譜/質譜法(LC /MS )

[19]

等,而且陸續有新方法、新技術出現。這些方法技術由于原理不同而各有所長。我國生活飲用水標準GB /T 20466－2006中水中微囊藻毒素的測定方法為固相萃取－高效液相色譜法(HPLC )和酶聯免疫法,最低檢出濃度均為0.1μg /L 。

高效液相色譜法(HPLC )是WHO 、美英等發達國家和我國權威機構推薦的MC 檢測方法。該方法具有準確、靈敏、重現性好,能同時分析出不同的MC 異構體等優點。但HPLC 監測技術往往需要標準毒素,而目前已發現60多種MC ,多數缺乏標準毒素,這限制了HPLC 的進一步應用。LC /MS 技術很好地解決了這一問題,即使沒有標準毒素,只要知道這種毒素的分子量,就可對其進行定性,而且LC /MS 技術亦可對毒素進行精確定量。圖3是本實驗室測定水中7種MCs 物質的總離子流圖

。

圖3七種MCs 物質總離子流圖(濃度:20μg /L )Fig.3TIC chromatogram of seven MCs compounds (20μg /L )

2前景和展望

高效液相色譜法(HPLC )主要應用于難揮發性有機物的分離分析,但是HPLC 方法只具備半定性能力,且針對痕量有機污染物靈敏度不夠高;而液質聯用技術(LC －MS )由于其高靈敏度和定性能力,近年來在環境監測領域逐步廣泛應用,其技術的成熟和發展,使傳統GC /MS 技術遺漏的髙極性、水溶性、高分子質量、熱不穩定性污染物逐步被鑒定出來。該方法靈敏度高,重復性好,常作為國外研究者的首選。

目前環境污染物檢測正從傳統的基于色譜和低分辨色譜/質譜聯用的靶標分析技術向基于高分辨色譜/質譜聯用以及色譜/串聯質譜聯用的高通量、高靈敏、高選擇、高甄別的非靶標分析方向發展。在色譜技術方面,全二維色譜和超高效液相色譜以其高通量、高分離、高靈敏成為很有應用前景的技術。在質譜檢測方面,QTOF /MS 將在新污染物的定性、結構鑒定方面發揮更大作用。可以預想通過這些技術的聯合將有更多潛在的污染物被甄別和篩選出來,而這些物質的鑒定正是進行環境安全評價和相關毒理研究的基礎,并為未來環境監測指引了方向。

遺憾的是非靶標分析目前仍處于初步的試探性優化階段,需要進一步加強方法的規范化和標準化。此外質譜數據庫和標準品的缺乏,也是新型污染物準確鑒定的壁壘之一。在發達國家,高效液相色譜/串聯質譜已經作為常規儀器在環境監測中普遍應用。而我國目前環境監測的標準化方法仍局限于氣相色譜、氣質聯用等常規技術,環境分析化學研究相對滯后。為了在此領域取得突破性進展,應積極推動色譜/質譜聯用技術的常規化使用。