液相色譜微型化：我們為什么這樣做？（二）

納升級、毛細管級和微流液相色譜的超高效液相色譜儀 (UHPLC)

計算得出的靈敏度增量實際上是常規和微型化液相色譜應用之間的比例因子，而流速是最好的例子。通常情況下，常規液相色譜中的流速（內徑為4.6 mm）為1000-1200μL/min，納升級液相色譜（內徑為75μm）為0.250-0.300μL/min。4000 的比率反映內徑為4.6 mm 的色譜柱與納升級液相色譜柱之間的比例因子，并將導致兩個色譜柱的線性速度（大致）相同。

Thermo Scientific^TM Dionex^TM UltiMate^TM 3000 RSLCnano 系統（圖3）旨在為現代納升液相色譜提供所需的非常低的流速和非常高的壓力。UltiMate 3000 RSLCnano 系統在UHPLC 壓力條件下，提供的流速可低至20 nL/min*、高至50μL/min，使其成為可實現納升級、毛細管級和微流速液相色譜分析的完美儀器。1 模塊具有內置柱溫箱，可支持一系列應用，同時可最大限度地縮短各種元件之間的物理距離。這可使連接管盡可能地縮短。

連接管的另一個重要方面是管路內徑。納升級液相色譜 (20 μm) 的連接管內徑大約比常規管路內徑小10 倍。通常，毛細管級和微流速液相色譜分別采用內徑為50μm 和 75 μm 的連接管。

如果正確連接合適的管路，就會得到最好的結果。Thermo Scientific^TM Dionex^TM nanoViper^TM 接頭系統可提供廠制、手緊UHPLC 接頭，零死體積。nanoViper 接頭和連接管及色譜柱集于一體，無需工具即可組裝，且沒有引入死體積或連接時毛細管斷裂的風險。

* 要求時才會提供最低流速

圖3. UltiMate 3000 RSLCnano 系統、內視圖和nanoViper 接頭

微型化液相色譜 - 應用領域

微型化液相色譜通常可分為三類或三種流速范圍：納升級、毛細管級和微流速液相色譜。納升級液相色譜是指流速低于1000 nL/min的應用，毛細管級液相色譜包含低流速范圍 (1–10 μL/min) 的應用，而微流速液相色譜涵蓋流速超過10 μL/min 的應用。

以下是各流速范圍的典型應用示例。第一個也是最常見的示例，納升級液相色譜應用于蛋白質組學發現工作流程中。在這里，樣品量的限制是使用納升級液相色譜的主要原因。在第二個例子中，毛細管級液相色譜被應用于復雜基質中目標肽的定量分析。樣品可能較易得到，但通量也很關鍵，毛細管級液相色譜可做到二者兼顧。對于第三個示例，微流速液相色譜被用來提高單克隆抗體 (MAb) 消化物分析中的通量。在這里，樣品量不再是限制因素，但增加的靈敏度和系統耐用性很有價值。最后，給出一個非生物分析的例子。

在蛋白質組學研究中，研究人員面臨著雙重挑戰。待研究的蛋白質濃度低且樣品體積小，導致含量極低。此外，樣品非常復雜。這些因素促使開發出納升級液相色譜系統和具有非常高分離能力的色譜柱，確保特殊應用，如圖4 所示。科赫爾 (K?cher) 等人進行了類似的實驗，他們通過在 50 cm 的色譜柱上進行8 小時梯度洗脫，從而在胰蛋白酶消化的HeLa 細胞中平均鑒別出2516個蛋白質。²

圖4. 在75 μm（內徑）×50 cm 的納升級液相色譜柱上經10 小時梯度洗脫后高分辨率分離的大腸桿菌消化物