液相色譜柱的使用與維護

☆ 液相色譜柱的安裝
 液相色譜儀由高壓液體泵、檢測器及液相色譜柱等三部分組成，其中液相色譜柱的正確安裝和使用，是液相色譜工作的關鍵；也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實驗數據的必經之路。
1、液相色譜柱的結構：
a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。
 柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件。在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網)，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b、柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。
正相柱：多以硅膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團(ODS)的非極性填料。也有無定型和球型之分。
常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒的粒徑在3—10 μm之間。
2、色譜柱的安裝：
a、拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內貯存的溶劑。
b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。
c、 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口相連接(如條件允許，建議在柱前使用保護柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內徑為0.1-0.3mm的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環。在接管時一定要設法降低柱外死體積。連接管通過空心螺釘、壓環后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止，再用扳手繼續順時針擰1／4-1／2圈，切記不要用力過大。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現象，請用扳手繼續順時針擰1／4圈，直至不漏液為止。壓環被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上(連接管通過壓環后露出的管長度應嚴格控制在2.5mm長或其他固定尺寸)。

☆ 液相色譜柱的使用
   色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，只有這樣，測得的結果才有可比性。
1、樣品的前處理：
a、最好使用流動相溶解樣品。
b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2、流動相的配制：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a、流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中(或長時間保留在柱中)。
b、流動相具有一定惰性，與樣品不產生化學反應(特殊情況除外)。
c、流動相的黏度要盡量小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液體泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
f、在流動相配制好后，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。
3、流動相流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。
當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。

☆ 液相色譜柱的日常維護

(1)每次開機時，流速和柱壓要逐漸增加，突然迅速增加，會使柱床受到沖擊，引起紊亂，產生空隙

(2)在進樣前使色譜系統充分平衡，是否平衡可由基線加以判斷

(3)在進樣前，檢查色譜系統的各個接頭，通常由此能發現是否有漏液現象。如有漏液，空氣會從漏縫  進人系統引起基線漂移，影響峰高和峰面積的重復性

(4)不要把柱接頭上得太緊，否則易損壞接頭螺紋，引起滲漏

(5)不要把柱子放在有氣流的地方或直接放到陽光下，氣流和陽光都會使柱子產生溫度梯度造成基線漂  移；如果懷疑基線漂移是由溫度梯度引起的，可以設法使柱子恒溫（配柱溫箱）

(6)若儀器用做常規分析，樣品種類有限，但分析次數很多，則不妨為每一類常規分析配置一根專用柱，  這樣有助于延長柱壽命

(7)如果懷疑樣品會污染色譜柱，可以用合適的溶劑(幾百毫升)慢慢沖洗柱子過夜，第二天早晨再用流動相重新平衡柱子(約3min)

(8)在因裝卸、更換、貯存等而挪動柱子時，動作要輕，不要使其受到碰撞，以免柱床因震動產生空隙或通道

(9)柱要加標簽，新舊分開，不要放在溫度變化很大的地方

(10)柱子不用或貯藏時，應封閉并貯存在惰性溶劑中

☆ 柱子的清洗

 1．柱子的清洗

   即使樣品和流動相已做過前處理，也仍難以完全避免柱子受到污染，因此必須對柱子行清洗。清洗應定期進行，如果在短期內分析許多樣品，則以每日清洗一次為宜，至少也應一周一次，防止有太多的雜質在柱上堆積。

反相柱的常規洗滌辦法是：分別取甲醇、三氯甲烷、水、甲醇各20倍柱體積（即對于一根4.6mm×25cm的柱來說，通常是50—60ml，而對于9.4mm×50cm的柱來說，通常是500--600m1），使之通過柱子。然后用流動相平衡（通常仍用20倍柱體積），柱一般將恢復正常。如果選擇性仍和以前不一樣，則表明還有其他雜質留在柱子里，這時應考慮更加嚴格的清洗：先用20倍柱體積的水，再用相同體積的0.05mol/L硫酸，最后用流動相溶劑、酸洗常能洗下有機溶劑所不能洗下的剩余雜質；在低pH值下做長期清洗是不適宜的，但50ml洗液以2ml/min的速度清洗25min，一般對鍵合相沒有損害。注意，強堿不能用來清洗任何微粒硅膠柱(不論是鍵合相還是非鍵合相)，因為硅膠骨架會溶解。對于嚴重污染的反相柱只能采用再生的方法。

 2．柱頭孔隙的處理

   拆下不銹鋼燒結過濾器后，檢查柱床，常可見柱頭塌陷，此時先剔掉無規則床層和帶色填料，使柱床呈白色并完全水平，再用甲醇作糊狀填料勻漿液，將填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液，重復數次，直到水平，完成了柱的再生。此時，如果柱頭孔隙深度小于1cm，可以采用下述局部重裝的辦法，否則，柱應當完全重裝或更換。

   柱入口局部重裝時采用的填料可以和原填料一樣，也可用玻璃珠。粒徑大于20um的可用敲打充填法干裝。如果粒徑小于20um則要用合適的溶劑配成勻漿，勻漿逐次加入，每次加入前都要使上一次加入的全部沉降。把孔隙填滿后，用刮刀將填料刮平，更換柱入口接頭，把柱重新接到液相儀器上，慢慢地增加流動相流速和系統壓力，直到操作上限為止。讓相當于10—20倍柱體積的流動相通過柱子，然后逐漸降低流速，并使壓力降為零，再把柱子卸下來，并卸下入口接頭，觀察柱的入口。此時孔隙應當減小，但是由于新加入的填料在系統的操作壓力下壓入柱頭，孔隙不可能一次就被全部充滿。重復上述重裝過程，直到柱上加不進更多的填料為止。一旦柱子填充完畢，可加進混合樣品，測定柱子的性能是否已經改善。

☆ 色譜柱的再生

高效液相柱是消耗品，會隨使用時間或進樣的次數增加，出現色譜峰高降低，峰寬加大或出現肩峰，柱效下降。需要定期進行徹底清洗和再生。

1.反相柱
   分別用甲醇：水＝90：10、純甲醇、二氯甲烷等溶劑著流動相，依次沖洗，每種流動相流經色譜柱不少于20倍的色譜柱體積。然后再以相反的次序沖洗。
2.正相柱
   分別用正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇等溶劑做流動相，順次沖洗，每種流動相流經色譜柱不少于20倍的柱體積（異丙醇粘度大，可降低流速，避免壓力過高）。注意使用溶劑的次序不要顛倒，用甲醇沖洗完后，再以相反的次序沖洗至正己烷。所有的流動相必須嚴格脫水。
3.離子交換柱
   長時間在緩沖溶液中使用和進樣，將導致色譜柱離子交換能力下降，。用稀酸緩沖溶液沖洗可以使陽離子柱再生，反之，用稀堿緩沖溶液沖洗可以使陰離子柱再生。
   用戶還可以選擇能溶解柱內污染物的溶劑為流動相做正方向和反方向沖洗。但再生后的色譜柱柱效是不可能恢復到新柱的水平的。    
   注意：如果柱子裝反了，可以調回來，但可能會造成柱內擔體塌陷。在不得已的情況下盡量不要反裝色譜柱。在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能成銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。 如果簡單的有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質，用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

☆ 色譜柱的平衡

每天用足夠的時間來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！------ 一定得做！
　　新的色譜柱在使用之前應該在您自己的液相色譜儀上進行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗報告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應時常對色譜柱進行測試。  
　　平衡色譜柱 　反相色譜柱在經過出廠測試后是保存在乙腈/水中的。請一定確保您所使用的流動相和乙腈/水互溶。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉，因此在用流動相分析樣品之前，應使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱；如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"。
　　硅膠柱或極性色譜柱在經過出廠測試后是保存在正庚烷中的。如果該色譜柱需要使用含水的流動相，請在使用流動相之前用乙醇或異丙醇平衡.平衡過程中，將流速緩慢地提高。
　　用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線（緩沖鹽或離子對試劑度如果較低，則需要較長的時間來平衡）
1.使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）
2.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍
3.避免流動相組成及極性的劇烈變化
4.流動相使用前必須經脫氣和過濾處理
5.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存大乙腈中
6.壓力升高是需要更換預柱的信號

☆ 反相系統換正相系統注意事項

   在液相色譜儀使用過程中，我們經常遇到液相色譜儀用戶正反相色譜系統互相現象，但由于使用操作不當，常常不注意間損壞了色譜柱，同時加重了液相色譜系統的污染，導致分析工作出現麻煩，現在將置換工作的基本流程列出，供用戶參考：

1.首先用甲醇(或已睛)將色譜系統包括反相柱平衡好(保證20分鐘內基線平直,無峰出現)；2.卸掉反相柱，封好保存；

3.將進樣閥與檢測器短路,用異丙醇沖洗色譜系統10分鐘(流速1ml/min)，在這期間空撥進樣閥三次；

4.換正己烷(硅膠柱)沖洗系統20分鐘(流速2ml/min)，此期間空撥進樣閥三次；

5.安上硅膠色譜柱， 流速調到1ml/min,用正己烷沖洗系統，直到系統平衡；

6.進三針標準品檢驗面積、保留時間是否重復,若不重復,繼續沖洗直到重復

☆ 正相系統換反相系統注意事項

在液相色譜儀使用過程中，我們經常遇到液相色譜儀用戶正反相色譜系統互相現象，但由于使用操作不當，常常不注意間損壞了色譜柱，同時加重了液相色譜系統的污染，導致分析工作出現麻煩，現在將置換工作的基本流程列出，供用戶參考：

1.首先用正己烷(硅膠柱)將色譜系統包括正相柱平衡好(保證20分鐘內基線平直,無峰出現)；

2.卸掉硅膠柱，封好保存；

3.將進樣閥與檢測器短路，用異丙醇沖洗色譜系統10分鐘(流速1ml/min).在這期間空撥進樣閥三次；

4.換甲醇(或已睛)沖洗系統20分鐘(流速2ml/min) ，此期間空撥進樣閥三次；

5.安上反相色譜柱， 流速調到1ml/min,用甲醇(或已睛)沖洗系統，直到系統平衡；

6.進三針標準品,檢驗面積 ﹑保留時間是否重復,若不重復,繼續沖洗直到重復。