液相色譜柱注意事項和維護液相色譜柱活化方法

　　液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱，或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相硅膠柱；反相柱填料主要以硅膠為基質，在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團（ODS）稱為C18柱，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重點介紹液相色譜柱的注意事項、維護、活化方法：

　　色譜柱在使用前，最好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。在做柱性能測試時要按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是最佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

　　一、液相色譜柱的維護分為： 色譜柱的平衡、色譜柱的再生、最后才是色譜柱的維護。下面詳解：

　　1. 色譜柱的平衡

　　反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方面獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長!操作步驟：

　　a. 平衡開始時將流速緩慢地提高，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線（緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低，則需要較長的時間來平衡）

　　b. 如果使用的流動相中含有緩沖鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動相平衡； 分析結束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護柱子。

　　2. 色譜柱的再生

　　長期使用的色譜柱，往往柱效會下降（柱子的理論塔板數減低）。可以對色譜柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。

　　色譜柱尺寸 柱體積 所用溶劑的體積

　　125-4mm 1.6ml 30ml

　　250-4 mm 3.2ml 60ml

　　250-10mm 20ml 400ml

　　選擇再生方法：

　　極性固定相（如Si，NH2* ，DIOL基色譜填料）的再生：

　　正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**

　　非極性固定相（如反相色譜填料RP-18，RP-8，CN等）的再生： 水→乙腈→氯仿（或異丙醇）→乙腈→水

　　注意：

　　a. 在對NH2改性的色譜柱進行再生時，由于NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗后用0.1M的氨水沖洗，然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。

　　b. 0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質，在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。

　　3. 色譜柱的維護

　　a.使用預柱保護分析柱（硅膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度）

　　b.大多數反相色譜柱的pH穩定范圍是2-7.5，盡量不超過該色譜柱的pH范圍

　　c.避免流動相組成及極性的劇烈變化

　　d.流動相使用前必須經脫氣和過濾處理

　　e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，應在實驗完畢柱子沖洗干凈，并保存于甲醇或乙腈中

　　f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

　　二、液相色譜柱的使用注意事項

　　(1)液相色譜柱色譜柱使用前注意事項：

　　液相色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，一定要注意液相色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應先用10%左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很容易析出，堵塞色譜柱。

　　(2)流動相：

　　流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水最好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經過0.45μm 的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統中的在線過濾器等裝置應該定期清洗或更換。

　　以常規硅膠為基質的鍵合相填料通常的pH值適用范圍是2.0-8.0。當必須要在pH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并完全置換掉原來所使用的流動相。

　　(3)樣品：

　　樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱（spe）對樣品進行預處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應嚴格脫水。

　　(1)反相液相色譜柱色譜柱每天實驗后的保養：

　　使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。

　　(2)長期保存色譜柱：

　　如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。

　　色譜柱在使用中最常見的問題：就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正常現象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點：

　　(1)色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；

　　(2)色譜柱頭的填料被樣品污染；

　　(3)色譜柱內緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出；

　　(4)流動相pH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。

　　解決辦法如下：

　　(1)如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10%的稀硝酸內超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。

　　(2)如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細修復后，重新安裝上柱頭螺絲。

　　(3)如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。

　　(4)如果因pH值使用不當，很難恢復。

　　三、液相色譜柱活化方法、新液相色譜柱活化多久？新液相色譜柱使用前還要活化么？

　　新買的液相色譜柱需要活化，活化的方法因柱子而異，普通反相C18柱的話我是這樣活化的：0.5ml/min流速的甲醇沖洗2小時以上。液相的新色譜柱都是保存在一定的保存液中的，所謂的活化就是替換掉其中的保存液，沖洗掉柱中可能殘留的其他雜質，以免影響后續分析工作。

　　不同的色譜柱活化的方法不盡相同，要根據柱子的種類來選擇活化方法。另外，要提醒的是，柱子活化時不要接檢測器，避免不必要的污染。

　　其它問答，新買氣相色譜柱活化時間多久合適？

　　急用的話，一兩個小時足矣。 一般都是晚上活化，不占用白天時間，一個晚上從低溫到高溫，再回到低溫，很慢地改變溫度走一遍就可以了。

　　液相色譜柱活化到底起到一個什么樣的作用？

　　1.排除有機相揮發所產生的起泡。

　　2.柱子一般是鍵合了c18的，用甲醇沖柱子就是使得這些集團達到更好的排列，有利于我們做樣。就像剛買的電池。