為了評價使用 250×0.2 mm PepSwift 整體柱時儀器的檢測限，采集了一系列進樣量的 LC/MS 樣品。將 50pg-20ng 的完整抗體從最低濃度開始注入色譜柱（圖 8）。在序列開始之前和各樣品之間運行兩針空白樣品，以排除殘留的影響。通過這種方法，我們發現完整抗體的最低檢測限是500pg，在進樣量為500pg的時候，仍然可以得到較好的譜圖，從譜圖上可以看到完整抗體中豐都最高的糖型。需要指出的是，最低濃度的樣品必須現配，分析前不能在自動進樣器中存放數小時。
圖 8. 用 250 mm×0.2 mm PepSwift 整體柱分析完整的利妥昔抗體，上樣量為 -20 ng-500pg 一系列稀釋濃度得到的一級全掃描質譜圖。
在 50 mm×1 mm 內徑 ProSwift 整體柱上，進樣量為 30 ng和 150 ng 的時候，完整抗體都可以得到高質量的譜圖（圖 9），
根據 30 ng 的上樣量，我們預測最低進樣量在 5 ng-10 ng 之間，在此范圍內仍然可以得到優質的譜圖。
圖 9. 用 50 mm×1 mm ProSwift 整體柱分析完整的利妥昔抗體，上樣量分別為150 ng 和30 ng時的一級全掃描質譜圖（左側）和最高豐度電荷態放大圖（右側）。
接下來，我們試圖進一步確認輕鏈和重鏈的序列，進行了兩類自上而下的實驗：在 HCD 池中進行全離子裂解（AIF），或選擇輕鏈和重鏈的 5 個電荷態進行多重（5-plex）目標離子二級質譜實驗。所有譜圖都是在分辨率為 70000下采集。目標離子譜圖的采集使用基于保留時間的質量數列表，包括先流出的輕鏈質荷比（保留時間 13.16 min：m/z 1536.96、1646.6、1773.3、1920.7、2095.4）和后流出的重鏈（ 保留時間 16 -20min：m/z 1584.6、1635.7、1684.7、1748.5、1810.9 ）。在這類實驗中，內含物列表中的第一個電荷態被選擇并送到 HCD 池中進行裂解，子離子儲存在 HCD 池中，同時分離第二個電荷態送到 HCD 池，裂解并貯存在該池中，直到第 5 個電荷態被裂解。5 個單獨分離和裂解步驟產生的所有離子被一起送到 Orbitrap 分析器中，產生一個單一的碎片離子譜圖。
所有歸為輕鏈的碎片離子（如圖 10 所示）在 N- 和 C- 末端都有好的覆蓋率，在序列的中間也有一些碎片離子匹配，最終的覆蓋率為 28%，占理論碎片的 15%。對于重鏈來說，兩種方法的裂解效率都不是特別好，約產生 20 個碎片離子，大多數都位于序列的末端。
為了進一步確認序列，采取了自下而上的方法，將蛋白進行還原、烷基化、并用胰蛋白酶進行酶切。圖 11 顯示的是酶切后肽段混合物的色譜圖。對數據進行數據庫檢索，數據庫由輕鏈、兩個重鏈變異體以及胰蛋白酶四個條目組成，結果顯示輕鏈的序列覆蓋率達 96%，重鏈的序列覆蓋率達 78.8%（圖 12）。兩個來自輕鏈的、較短的、沒有檢測到的肽段（LEIK 和 EAK）只能在一級質譜圖中以完整質量數的形式檢測到，而肽段 EAK 可以根據含漏切位點 的肽段EAKVQWK 所對應的準確質量數進行鑒定。綜合二級譜圖鑒定的肽段和完整短肽的準確質量數，輕鏈的序列覆蓋率是 100%。
圖 10. 根據通過 AIF 實驗得到的碎片離子匹配利妥昔抗體輕鏈的序列覆蓋率。鑒定到 17 個 b 離子和 50 個 y 離子，對應 15.7% 的理論碎片離子數。（426 個理論碎片離子中鑒定到 67 個離子）