液質聯用法測定大鼠血漿中齊墩果酸的濃度

液質聯用法測定大鼠血漿中齊墩果酸的濃度

　　齊墩果酸（oleanolic acid，OA） 為一種五環三萜類化合物，以游離體和配糖體的形式廣泛分布于青葉膽、女貞子等雙子葉植物的 60 個科約 190 種植物中[1-2]。本文建立并優化了大鼠血漿中齊墩果酸濃度的高效液相色譜-質譜聯用測定法。方法快速簡便，靈敏度高，重現性和專屬性好，結果滿意。 
　　1 材料 
　　1.1 藥品與試劑 
　　OA標準品（中國藥品生物制品鑒定所批號：110709-200505），內羅紅霉素（roxithromycin，ROX，中國藥品生物制品檢定所，批號130351-0608），甲醇（色譜純），試驗用水為樂百氏純凈水，其余試劑均為分析純。 
　　1.2 儀器 
　　島津LCMS-2010A液-質譜聯用儀，含自動進樣器、在線脫氣系統、柱溫箱、二元梯度泵，Sigma 3K30臺式超高速冷凍離心機。 
　　1.3 動物 
　　SD大鼠，雄性，體重（200±20）g，南昌大學醫學院實驗動物中心提供。 
　　2 方法 
　　2.1 質譜條件 
　　色譜柱：Shimadzu Pack VP-ODS C18 5μm×150mm×2.0mmI.D；流動相：乙腈∶水（含0.1%冰醋酸銨）=53∶47（v/v）；流速：0.2mL/min 柱溫：35℃；采集方式：選擇性離子監測；離子極性：負離子；離子化方式：電噴霧離子化；檢測對象：齊墩果酸M/Z=455.70；羅紅霉素M/Z=734.30；檢測電壓：1.5kV，霧化氣體流速 2.0L/min；曲型脫溶劑裝置溫度250℃；加熱塊溫度 250℃。 
　　2.2 血漿樣品的處理 
　　取0.1mL血漿，精密加入20μL內標ROX，40μL 0.1mol/L Na2CO3溶液，混勻后加4.0mL乙酸乙酯，振蕩4min，4500rpm離心10min，取上清液3.0mL，置50℃干浴鍋中氮氣揮干，以0.3mL甲醇溶解殘渣，再經18000 rpm 離心10 min后，取5μL進樣，用峰面積進行定量分析。 
　　3 結果 
　　3.1 色譜行為 
　　血漿中雜質對測定無明顯干擾，ROX峰保留時間為1.9min，OA峰保留時間為1.5min。專屬性色譜圖見圖1。 
　　3.2 線性范圍及最低定量下限 
　　取離心管數支，分別精密加入不同量的OA標準溶液20μL，再加入空白血漿180μL，渦旋混勻成25，50，100，200，400，600，1200ng/mL標準含藥血漿，按“2.2”項操作，記錄色譜圖，計算OA峰面積和內標峰面積的比值，計算OA面積（Aa） 和內標峰面積（Ai） 的比值f。以f 對c作回歸計算，得回歸方程：Y = 0.01343X-0.06263（r=0.9997）。線性范圍為：25～1200ng/mL按上述條件測得OA在血漿中的最低定量限為25ng/mL。 
　　圖1 （左邊為OA，右邊為內標）A：空白血漿色譜圖； 
　　B：空白血漿加入內標ROX和OA色譜圖C大鼠給予OA的血漿加入內標ROX樣品色譜圖 
　　3.3 回收率及精密度試驗 
　　配制濃度為50、400、1000 ng/mL OA標準血樣，按本文“2.2”項操作，每一濃度制備并測定5個樣品，3d連續制備并測定3個分析批。計算其回收率及精密度符合要求 
　　3.4 穩定性試驗 
　　精密配制含OA50、400、1000ng/mL的標準血樣，分別經由血樣處理后室溫放置0、6 、12h及在-20 ℃冷凍保存3d后測定血樣中OA的濃度，考察其穩定性，結果表明穩定性良好。 
　　4 結論 
　　本文建立并優化了大鼠血清中齊墩果酸濃度的高效液相色譜-質譜聯用測定法。方法快速簡便，靈敏度高，重現性和專屬性好。