液質聯用色譜測定聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺含量

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺聚合的高水溶性高分子, 近年來廣泛應用于食品、供水、冶煉和醫用材料中。自1967年以來聚丙烯酰胺作為軟組織填充物逐漸應用在美容整形手術中。俄羅斯和烏克蘭目前累計受術者3萬例左右, 我國目前累計受術者近30~50萬, 絕大多數為隆乳患者。但由于聚丙烯酰胺在聚合過程中往往會殘留游離的丙烯酰胺, 假如其濃度超標, 將會對人體造成不同程度的傷害。動物實驗和體外細胞實驗證實丙烯酰胺可導致遺傳物質改變和癌癥發生。在臨床應用中發現植入前膠體呈透明、粘稠膠狀; 植入后取出時膠體為淡黃色, 乳糜樣, 粘度降低。因此聚丙烯酰胺水凝膠在植入人體后是否會分解為單體成為人們關注的焦點之一。為了解聚合物進入人體后丙烯酰胺的含量變化, 我們有必要尋求一種準確、簡便地測定聚丙烯酰胺中丙烯酰胺的含量, 以對目前頻頻報道的各類臨床并發癥作出科學解釋。目前用于測定丙烯酰胺含量的方法主要有溴化法、改良溴化法、紫外分光光度法等。但大多存在準確度不高, 易受干擾等缺點。根據文獻資料, 液質聯用色譜法(HPLC-MS/MS)能更準確地監測聚丙烯酰胺水凝膠中丙烯酰胺的含量。

材料和方法

一、儀器

1.液相色譜-質譜/質譜聯用儀(HPLC-MS/MS) LTQ型線性離子阱質譜儀(Thermo Finnigan公司), 配備Surveyor高效液相色譜儀(Thermo Finnigan公司)。

2.其他儀器 組織粉碎機, 旋轉蒸發儀, 氮氣濃縮器, 振蕩器, 超純水裝置, 電子分析天平(十萬分之一), 電子分析天平(千分之一), 玻璃層析柱 (柱長30 cm, 柱內徑1.8 cm), 渦漩混合器。

二、材料

1.試劑 甲酸(分析純, 北京試劑品公司)、甲酸(色譜純, Dikma公司)、甲醇(色譜純, J& T BAKER公司)、正己烷(分析純, 北京試劑品公司, 重蒸后使用)、乙酸乙酯(分析純, 北京試劑品公司, 重蒸后使用)、硫酸銨(分析純, 北京試劑品公司)、無水硫酸鈉(分析純, 北京試劑品公司)、超純水、工業氮氣(純度> 99.5%, 濃縮使用)、高純氦氣[純度> 99.995%, 液質聯用色譜(LC-MS)分析用碰撞氣]、液氮(LC-MS分析用脫溶劑氣)、Extrelut^TM 20硅藻土(德國Merck公司)。

2.聚丙烯酰胺樣本 聚丙烯酰胺標準品為奧美定, 由吉林富華醫用高分子材料有限公司生產(批號20040105MJ01); 丙烯酰胺標準品由Fluka公司提供(純度> 99.8%, ); ¹³C₃-丙烯酰胺標準品由美國Cambridge Isotope Laboratories公司提供。聚丙烯酰胺臨床樣本為整形外科聚丙烯酰胺水凝膠注射隆乳患者手術取出的膠體, 共20例。

三、色譜條件

色譜柱:MG120 C18柱(5 μ m粒徑, 150 mm× 4.6 mm, I.D.SHISEIDO公司); 流動相及洗脫條件:流動相為甲醇:0.1%甲酸(1:9), 恒度洗脫; 流速:0.6 mL/min; 柱溫:26 ℃; 進樣體積:10 μ L。

四、質譜參數

離子源:陽離子大氣壓化學電離源(APCI+); 放電電流:5 μ A; 加熱毛細管溫度:300 ℃; 鞘氣(氮氣):30 Arb; 輔助氣(氮氣):10 Arb; 掃描方式:二級全掃描; 源內誘導解離電壓(CID):5 V; Q值(Activiation Q):0.5; 碰撞能量:40%; 丙烯酰胺:母離子 72、子離子55; ¹³C₃丙烯酰胺:母離子 75、子離子58; 定量離子:丙烯酰胺為55, ¹³C₃丙烯酰胺為58。

五、標準溶液的配置

1.丙烯酰胺標準溶液配制 (1) 儲備溶液(1 000 mg/L):十萬分之一天平準確稱取丙烯酰胺標準品10 mg(精確到0.01 mg)于10 mL棕色容量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度, -20℃冰箱保存; (2) 中間溶液(100 mg/L):準確移取儲備液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度, -20℃冰箱保存; (3) 使用溶液I(10.0 mg/L):準確移取中間溶液1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中, 加0.1%甲酸溶液稀釋至刻度, 現用現配; (4)使用溶液Ⅱ (1.00 mg/L):準確移取使用溶液I 1.00 mL置于10 mL棕色容量瓶中, 加0.1%甲酸溶液稀釋至刻度, 現用現配。

2.¹³C₃-丙烯酰胺內標溶液配制 (1) ¹³C₃-丙烯酰胺內標儲備溶液I(1 000 mg/L):準確稱取¹³C₃-丙烯酰胺標準品10 mg(精確到0.01 mg)于10 mL棕色容量瓶中, 用甲醇溶解并稀釋至刻度, -20℃保存; (2) 內標儲備溶液Ⅱ (10 mg/L):準確移取內標儲備液I 1.00 mL, 置于100 mL容量瓶中, 甲醇稀釋至刻度, -20℃冰箱保存; (3) 內標使用液(1.0 mg/L):準確移取內標儲備液Ⅱ 1.00 mL, 置于100 mL容量瓶中, 甲醇稀釋至刻度, -20℃冰箱保存。

六、樣本提取

稱取樣本2.00 g (精確到0.01 g), 加入10 mg/L ¹³C₃-丙烯酰胺內標10 μ L, 加超純水10 mL, 振蕩30 min, 于4 000 r/min離心10 min, 取上清液。

七、樣本凈化

取上清液加入硫酸銨固體8 g, 振蕩10 min, 使充分溶解, 于4 000 r/min離心10 min, 取上清液10 g, 備用。取潔凈玻璃層析柱, 在底部填少許玻璃棉, 壓緊, 依次填裝無水硫酸鈉10 g、Extrelut^TM 20硅藻土2 g。稱取5 g Extrelut^TM 20硅藻土, 與上述備用的樣本上清液攪拌均勻后裝入層析柱中。用正己烷60 mL淋洗, 控制流速2 mL/min, 棄去正己烷淋洗液。用60 mL乙酸乙酯洗脫丙烯酰胺, 控制流速2 mL/min, 收集乙酸乙酯洗脫溶液, 并在45 ℃水浴下減壓旋轉蒸發至近干, 用乙酸乙酯洗滌蒸發3次(每次1 mL), 將旋轉蒸發的樣本液轉移至已加入1 mL 0.1%甲酸的試管中, 渦旋振蕩。在氮氣流下吹去上層有機相后加入1 mL正己烷渦旋振蕩, 于3 500 r/min離心5 min, 取下層水相過0.22 μ m水系濾膜進行HPLC-MS/MS分析。

八、標準曲線繪制

將樣本和系列標準注入HPLC-MS/MS系統, 記錄丙烯酰胺和內標的峰面積。計算丙烯酰胺[質量數(m/z) 55]和¹³C₃-丙烯酰胺內標(m/z 58)的峰面積比, 以各系列標準溶液的進樣量(ng)與對應的丙烯酰胺(m/z 55)和¹³C₃-丙烯酰胺內標(m/z 58)的峰面積比繪制線性曲線。

九、結果計算

按下式用內標法計算樣本中丙烯酰胺的含量(C_n, μ g/kg):

C_n= An×msAs×相對響應因子(RRF)×m$\begin{array}{c}\frac{A_n\times m_s}{A_s\times \mathit{相對響應因子}\left(\mathit{RRF}\right)\times m}\end{array}$

式中: m_s為樣本中加入內標的量(ng); A_n為目標化合物的峰面積; A_s為定量內標的峰面積; m為取樣量(g)。

按下式計算RRF:

RRF= An