淀粉酶的專一性和溫度、pH、激活劑及抑制劑對酶活性的...

原理
酶具有高度專一性，一種酶只能催化一種或一類底物發生反應，如淀粉酶只能水解淀粉，不能水解蔗糖。當淀粉被淀粉酶徹底水解為還原性麥芽糖和葡萄糖時，能使班氏試劑的Cu2+還原成Cu1+，生成磚紅色Cu2O沉淀。淀粉酶的活性受溫度、pH、激動劑及抑制劑、酶濃度以及作用時間等多種因素影響，因而水解淀粉生成一系列分子大小不同的糊精。不同程度的水解糊精可與碘反應生成紫色、棕色或紅色絡合物。通過上述特征性反應，并以蔗糖等作對照，便可觀察、驗證淀粉酶是否具有專一性以及它的催化活性是否受到影響。
操作方法
一、唾液淀粉酶的收集與處理
1.制備唾液
實驗者先將痰咳盡，用自來水漱口，以清除口腔內食物殘渣，再在口腔內含蒸餾水約15ml，并作咀嚼咕漱運動，3分鐘后吐入墊有兩層經潤濕處理的脫脂紗布的漏斗內，過濾于小燒杯中備用，為與下面稀釋唾液相區別，此稱制備唾液。
2.煮沸唾液
取上述唾液約2ml，盛入1中號試管中,置沸水浴煮沸5分鐘備用。
3.稀釋唾液
調整唾液淀粉酶活性，使之在pH6.8、37℃和既無激動劑又無抑制劑條件下，作用5min，水解淀粉至紅色糊精為宜。具體做法是取12凹白瓷反應板一塊，按下列步驟操作：
①第1排每凹各加1滴制備唾液，12、13、14凹分別加生理鹽水1、2、3滴，用滴管采用抽吸法，由稀到濃（14→12）小心混勻各凹，勿使濺入相鄰凹中。每混勻一凹便取其1滴放入同列的2排凹中，剩余稀釋唾液應全部放回原凹中。

②在盛有不同稀釋度唾液的第2排各凹中，均加入4滴緩沖液（pH6.8），2滴1%的淀粉液和2滴蒸餾水，用①混勻法充分混勻，置37℃下5min。
③在第2排各凹中加I液一滴，混勻，觀察比較各凹顏色，以淺棕-紅色對應的稀釋倍數，用生理鹽水稀釋3ml制備唾液備用。

二、唾液淀粉酶的專一性以及溫度、pH、激活劑和抑制劑對唾液淀粉酶活性影響的觀察
（一）取試管3支編號，按下表1操作

表1 唾液淀粉酶專一性的實驗觀察

將上述各管混勻后 置37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入班氏試劑20滴，再放入沸水浴中煮沸約15分鐘，觀察各管顏色反應，并說明原因。

（二）溫度影響酶促反應的實驗觀察
1.取試管3支編號，按下表2操作：表2 溫度影響酶促反應的實驗觀察

2.將一、二管移入冰水浴中，待各管溫度一致后速向各管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區別，并說明溫度對酶促反應的影響。

四、pH影響酶促反應的實驗觀察

1. 取試管3支編號，按下表3操作：

表3 pH影響酶促反應的實驗觀察

2.將上述各管混勻后，置37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀察各管顏色的區別，并說明pH對酶促反應的影響。

五、激動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察

 1. 取試管4支編號，按下操作：

表4 激動劑和抑制劑影響酶活性的實驗觀察

2. 將上述各管放入37℃水浴中保溫10分鐘，然后每管加入碘液1滴，混勻后觀各管顏色的區別，并說明激動劑和抑制劑對酶促反應的影響。

注意事項

1.反應試管應清洗干凈，不同酶液、試劑及其滴管不能交叉混用；

2.使用混合唾液，或通過預試選出合適的唾液稀釋度，效果更為顯著。

 試劑和器材

一、器材
1.滴管、燒杯、試管（架）及試管夾。
2.恒溫水浴箱與水浴鍋。
3.脫脂棉、漏斗及紗布。
4.白瓷反應盤

二、試劑
1.1％淀粉稱取淀粉1g，加少量水調成糊狀，加入煮沸的0.3％NaCl溶液至100m1。
2.1％蔗糖溶液
3.班氏試劑 A液：取檸檬酸鈉173ｇ，無水碳酸鈉100ｇ，加水600ml，加熱溶解，冷卻后稀釋至850ml；B液：取結晶硫酸銅（CuSO4·5H2O）17.3ｇ溶于100ml預熱的蒸餾水中，冷卻后加水至150ml。將A液緩慢倒入B液中混勻置試劑瓶備用。
4.碘液：稱取碘4g、碘化鉀6g溶于l000ml蒸餾水中，置棕色瓶內貯存備用。
5.各種pH緩沖液
⑴pH6.8緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液772ml，0.1mol/L檸檬酸溶液228ml混合即成。
⑵ pH4.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液385.5ml，0.1mol/L檸檬酸溶液614.5ml混合即成。
⑶ pH8.0緩沖液：取0.2mol/LNa2HPO4溶液972ml，0.1mol/L檸檬酸溶液28ml混合即成。6.0.9％ NaCl 溶液
7.1％CuSO4 溶液
8.1％Na2SO4溶液