淀粉酶活性的測定

一、原理

淀粉酶（amylase）包括幾種催化特點不同的成員，其中α－淀粉酶隨機地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉漿的粘度下降，因此又稱為液化酶；β－淀粉酶每次從淀粉的非還端切下一分子麥芽糖，又被稱為糖化酶；葡萄糖淀粉酶則從淀粉的非還原端每次切下一個葡萄糖。淀粉酶產生的這些還原糖能使3，5－二硝基水楊酸還原，生成棕紅色的3－氨基－5－硝基水楊酸。淀粉酶活力的大小與產生的還原糖的量成正比。可以用麥芽糖制作標準曲線，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內生成的還原糖的量表示酶活力。幾乎所有植物  中都存在有淀粉酶，特別是萌發后的禾谷類種子淀粉酶活性最強，主要是α－和β－淀粉酶。Α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化；而β－淀粉酶不耐熱，在70℃15min則被鈍化。根據它們的這種特性，在測定時鈍化其中之一，就可測出另一個的活力。本實驗采用加熱鈍化β－淀粉酶測出α－淀粉酶的活力，再與非鈍化條件下測定的總活力（α＋β）比較，求出β－淀粉酶的活力。

二、材料、儀器設備  及試劑

（一）材料：萌發的小麥種子（芽長約1cm）。

（二）儀器設備：1. 分光光度計  ；2. 離心機；3. 恒溫水浴（37℃，70℃，100℃）；4.具塞刻度試管；5. 刻度吸管；6. 容量瓶。

（三）試劑（均為分析純）：1. 標準麥芽糖溶液（1mg/ml）：精確稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml；2. 3，5－二硝基水楊酸試劑：精確稱取1g3，5－二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾后使用；3.01mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液：A液（0.1mol/L 檸檬酸）：稱取C6H8O7.H2O 21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液；4.1％淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。

三、實驗步驟

（一）麥芽糖標準曲線的制作：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表（詳教材）加入試劑。搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。以1號管作為空白調零點，在540nm波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫座標，吸光度值為縱座標，繪制標準曲線.

（二）酶液制備：稱取1g萌發3天的小麥種子（芽長約1cm），置于研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿。將勻漿倒入離心管中，用6ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管。提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數min攪動1次，使其充分提取。然后在3000rpm下離心10min，將上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液10ml，放入50ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液。

（三）酶活力的測定：取6支干凈的具塞刻度試管，編號，按表（詳教材）進行操作。

（四）結果計算：淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×T)(mg/g/min)。式中，C為從標準曲線上查得的麥芽糖含量（mg）；VT為淀粉酶原液總體積（ml）；Vs為反應所用淀粉酶原液體積（ml）；W為樣品重量（g）；t為反應時間（min）。