淋巴細胞的分離和激化實驗

實驗概要

本實驗從全血中收集富含白細胞的血漿，然后通過Ficoll-Hypaque離心，沉淀細胞懸于含不同細胞分裂劑的培養基中，刺激細胞生長。

主要試劑

1. PBS（Dulbecco）：
   0.10g/L 無水CaCl₂
   0.20g/L KCl
   0.20g/L KHPO₄
   0.10g/L MgCl₂.6H₂O
   8.00g/L NaCl
   2.16g/L NaH₂PO₄.7H₂O
   調pH至7.4

2. 生長培養基：
   不含谷氨酰胺的RPMI 1640培養基
   10% FBS
   慶大霉素（可不用）（10μg/ml）
   2mmol/L L-谷氨酰胺
   1mmol/L 丙酮酸鈉

3. 促細胞分裂劑（終濃度）
   5μg/ml PHA：1mg/ml母液-20℃分裝凍存
   25μg/ml 刀豆凝集素A（conA）：0.4mg/ml母液-20℃分裝凍存
   商陸促分裂原：再水華母液-20℃分裝凍存

實驗步驟

1. 收集10ml全血，加入不含防腐劑的肝素（0.2ml肝素/10ml全血）。實驗全過程保持無菌操作。
2. 在15ml離心管中的肝素化血中加入1ml 6%葡萄糖，室溫放置20~30min，沉降紅細胞。沉降時間不宜過長，否則單核細胞將不再保留在富含白細胞的血漿。
3. 從葡聚糖處理的血中小心收集紅細胞上層的富含白細胞的血漿。
4. 富含白細胞的血漿室溫300g離心8min，沉淀細胞。
5. 棄上清，細胞輕懸于1ml PBS中。
6. 于室溫下，用無菌巴斯德吸管小心將細胞懸液加在5ml Ficoll-Hypaque之上。此步操作要技術熟練，才能保持血漿曾在Ficoll-Hypaque層之間界面清晰。
7. 400g低溫（4℃）離心30min，沉淀細胞。離心后切記不要破壞管中的分層。
8. 淋巴細胞在血漿和Ficoll-Hypaque層之間的白色渾濁條帶中，小心取出貯存，棄紅細胞沉淀。
9. 5ml PBS洗一次細胞，室溫250g離心5min，沉淀細胞懸于3~5ml生長培養基中。
10. 全部細胞懸液轉移至T25組織培養瓶，加促細胞分裂劑。