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  • 發布時間:2021-04-26 18:31 原文鏈接: 淋病的實驗室診斷和藥敏分析(二)

           PPNG菌株是1976年首次在實驗室分離得到的,該菌中含有編碼產青毒酶的基因,該基因既可整合于染色體上也可出現在質粒DNA中,而后者居多,稱之為產青毒素酶質粒,質粒有二種,大小分別為7.4kb和5.3kb。Pescador1998年設計一特異的檢測淋球菌編碼β-內酰胺酶基因的探針,采用酶化學發光法標記,液相雜交,用測光計測是特異雜交體的光量。在4h內可檢測104-105CFU的PPNG菌株。TRNG菌株雖對四環素耐藥,但通常對β-內酰胺酶類及喹諾酮類抗菌素敏感。因此,在實驗室藥敏檢測中可歸為敏感細菌。Pescador用抗四環素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探針,該基因介導抗四環素,用酶化學發光標記,液相雜交,4h內可直接從臨床標本中檢出含有tetm基因的1.5×104CFu的淋球菌。

           (2)染色體探針

           染色體探針包括已知功能的基因探針,如菌毛DNA探針和paI基因探針,這些基因在淋球菌感染人細胞的過程中起著重要作用;未知功能的基因探針,這些探針序列與染色體的特定序列互補,但目前還不知這些基因序列的功能。以上兩種染色體探針由于在淋球菌中互補序列的拷貝數較低,檢測靈敏度較低,因此一般用的不多,除非有特殊的研究目的。

           (3)rRNA基因探針

           rRNA基因探針是將與rRNA互補的DNA作為探針,該探針的靶序列是rRNA序列。rRNA的基因探針的特點是:①可以增加探針檢測的靈敏度,rRNA基因探針可同時檢測rRNA分子和DNA分子;②rRNA具有進化上的保守性;③雜交方法簡便、快速;④由于rRNA的含量較高,標本不需增菌。美國Gen-Probe公司生產的淋球菌檢測探針PACE C,是以rRNA 及其基因為檢測靶序列,采用放射性標記,在2h內可以完成檢測,Peter用這種探針檢測395個臨床標本,結果靈敏度和特異性分別為92.9%,99.4%,他認為PACE C系統篩查臨床標本中淋球菌是一個可靠的方法。該探針還可以檢測無癥狀淋球菌感染者,這是目前培養難于達到的。

           2、淋球菌的基因擴增檢測

           上面講述的探針技術檢測淋球菌的方法,雖然比培養方法在靈敏度,特異性和方便性上有了很大的提高,但其仍有一定的局限性,如多數情況下需要標本的淋球菌濃度很高,PCR技術和連接酶鏈反應的出現進一步提高了檢測淋球菌的靈敏性,它具有快速、靈敏、特異、簡便的優點,可以直接檢測臨床標本中極微量的病原體。

           (1)淋球菌DNA的提取

           ①培養菌的DNA提取

           將培養得到的淋球菌,以102cfu/ml的濃度溶于堿性裂解液中裂解,裂解液組成為:1M NaCl 1M NaOH和1%Sodium dodecyl sulphate。將裂解液混勻后煮沸1min,然后用100μl 的1M Tris pH7.0中和堿性裂解液。用Tris平衡酚提抽一次,酚—氯仿抽提一次,然后用無水乙醇或異丙醇沉淀DNA,提取的DNA溶于30μl蒸餾水或TE緩沖液中。

           ②臨床棉拭子標本的提取

           將貼有分泌物的棉拭子在2ml的無菌生理鹽水中或PBS緩沖液中擠壓洗1min,以便將標本盡量溶于溶液中,將棉拭子棄去,懸浮液于2-3000r/min離心5min,吸去上清液,細胞重新溶于100μl 1×PCR緩沖液,其中含Tween 20 0.45%,蛋白酶K 200μg/ml,細胞懸浮液于50-60℃溫浴1h,然后95℃加熱10min以滅活蛋白酶K,12000 r/min離心10min,上清液含DNA模板。


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