溶解受體的凝集素親和層析實驗

麥胚凝集素（WGA)-瓊脂糖 溶解的胰島素受體 牛血清白蛋白 [125I] 胰島素（受體級） 豬胰島素 牛γ-球蛋白 聚乙二醇 6000 溶液 D 溶液 E 結合緩沖液

一次性小型塑料柱

材料與設備

麥胚凝集素（WGA)-瓊脂糖（~2.5 ml 沉積的微球）（Vector Laboratories,Inc.ALI023 或 EY Laboratories,Inc.A2101)

溶解的胰島素受體（得自實驗 2)

一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories）

牛血清白蛋白（BSA,1%)

[125I] 胰島素（受體級）（DuPont NEN NEX 196)

豬胰島素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml)，于 0.001mol/L HCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)

牛γ-球蛋白（0.4%, 于醇液 B 中）（Miles Laboratories,Inc，82-041-2)

聚乙二醇 6000(20% 水溶液）

試劑

溶液 D

溶液 E

結合緩沖液（溶解受體用）

(配方，見“試劑的配制”，PP.234?240)

操作程序

凝集素親和層析

1) 用 25 ml 溶液 D 清洗 2.5 ml WGA-瓊脂糖，去除未偶聯的 WGA。

2) 將 10~15 mg 溶解的胰島素受體（~5 ml) 與 2.5 ml 洗后的 WGA-瓊脂糖混合，混合物在 4°C 下輕輕搖動 16 h 或室溫 1 h。

3) 將瓊脂糖倒入一次性小型塑料柱中，用 15 ml 溶液 D 淋洗。

4) 用 15 ml 溶液 E 洗脫胰島素受體。分部收集 0.5-ml 組分，用微量蛋白測定法 (microprotdnassay）測定各組分的蛋白濃度。合并含蛋白濃度峰的組分；這通常可得到約 3 ml 0.3 mg/ml 的蛋白。
注：蛋白主峰通常在第 3~6 管組分即約 1/2 柱體積處，且峰形相當尖。應保持疑集累層析柱的試劑緩沖液和瓊脂糖在相同的溫度。使用不同溫度的試劑，會產生氣泡和引起柱內的不均-性，導致洗脫蛋白的分辨率下降。

胰島素與部分純化受體結合量的測定

1) 于微量離心管中建立如下反應體系:



A 管的結果給出總結合量，B 管的結果給出非特異結合量。特異結合量=A 管的 cpm 值-B 管的 cpm 值。
注：購自 DuPont NEN 公司的受體級 [¹²⁵I] 胰島素（NEX196) 的比活為 2200uCi/nmoL。胰島素濃度為 35.5nmol/L。對于本試驗，必須將 [_¹²⁵I] 胰島素儲液用緩沖液（50 mmol/L HEPES、0.1%Triton X-100、0.1% BSA,pH7.4) 稀釋至 5nmol/L 對于部分純化的受體來說，結合試驗所需 [¹²⁵I] 胰島素的終濃度應為 500pmol/L, 這在 300-ul 反應體系中相喪于 30ul 5nmol/L 的溶液。

2) 上述反應體系 4℃孵育 16 h，或室溫賦育 2 h。

3) 沉淀法將受體結合的胰島素與游離的胰島素分開。加 75ul 0.4% 牛γ-球蛋白，4℃ 孵育 5 min。再加 375420% 聚乙二醇 6000，4℃ 孵育 10 min。

4) 混合物用微型離心機離心 10 min，收集沉淀物。

5) 盡量去除各管上清后，計數測定沉淀物的放射性強度。

結果

用 WGA-瓊脂糖親和層析純化溶解胰島素受體的典型結果，如圖 4-5 和表 5 所示。