按 “載體兩性電解質 pH 梯度等電聚焦” 所述的方法配制 T=5%，C=3% 的等電聚焦凝膠，并進行等電聚焦。為使在第二向電泳時，樣品分子有強的電荷，以便在短時間內完成第二向電泳，保證滴定曲線的精確性以及為使樣品有完整的滴定曲線，一般應選擇寬 pH 范圍（pH 3.5~9.5 或 pH 3.5~10 )。
第一向電泳結束后，切去電極條（電極條中的鹽會干擾第二向電泳 )，將此凝膠轉 90°。在與加樣孔平行的方向常規聚丙烯酰胺凝膠電泳用的電極條，（如進行半干電泳)，加樣，然后盡快進行第二向電泳，以免 pH 梯度擴散。在第二向電泳時可以用相對比較高的電壓，電泳時間便大大縮短。
由于樣品中的高鹽和緩沖液離子在第二向電泳時的不均勻導電性會干擾結果，故應用透析或其他方法脫鹽。
加樣量取決于凝膠的大小、厚度、加樣孔的大小和染色方法。如用考馬斯亮藍染色，5 倍于常規的量。
第二向電泳后，用表面電極測定 pH 梯度。 展開 | 