五、激光掃描共焦顯微鏡技術的應用
定位、定量
三維重組
動態測量
¨ 活細胞或組織內游離Ca2+濃度的測量
¨ 活細胞內H+濃度（ pH值）的測量
¨ 自由基的檢測
¨ 藥物進入細胞的動態過程、定位分布及定量
應用：細胞膜電位的測量
熒光漂白恢復（FRAP）的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉移（FRET）的測量
其他應用
1、定位、定量
免疫熒光標記（單標、雙標或三 標）的定位、定量。如：細胞膜受體或抗原的分布，
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細胞器的共定位
細胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交： 染色體基因定位
單細胞凝膠電泳
GFP的表達
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1）Amine-Reactive Probes與抗體耦聯、與配體耦聯、與肽耦聯、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）異硫氰基熒光素 494/518
4）TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻紅蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690
(1)細胞表面抗原、胞內某種蛋白
免役熒光標記： 與抗體耦聯,
直標: 一抗+熒光探針
間標: 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針
(2)細胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC
2.標記細胞器熒光探針
(1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細胞，陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數細胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發紅光
可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電
位最佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細胞或固定細胞 ,
穩定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red
(3)內質網 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標記內質網,較低濃度標記線粒體
(4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細胞 ¨細胞器的單克隆抗體
(5)細胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細胞
SYTO 活細胞
3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發現：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結合后可產生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經證實在水母體內還存在另外一種發光蛋白即綠色熒光蛋白
GFP, 后經研究表明，在水母體內Ca2+和腸腔素與水母發光蛋白結合后，水母發光蛋白產生藍色熒光，GFP在藍光的激發下，產生綠色熒光
。將外源基因與GFP DNA 相連, GFP可作為外源基因的報告基因實時監測外源基因的表達.
GFP主要應用: 對活細胞中的蛋白質進行準確定位及動態觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中的時空表達
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉染細胞, 可動態觀察該分泌蛋白分泌到細胞外的過程
GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細胞中細胞核、內質網、高爾基體、線粒體等細胞器的
結構及病理過程:定位與定量測量應注意的問題
定位：1.可以對圖像進行修飾，
2.pinhole 可盡可能的小。
3.確認共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像
定量：
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進行定量測量
3.Pinhole盡可能的大
六.顯微CT與三維重組
光切的層數：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.動態測量 Physiology:細胞內離子動態變化測量
1).游離Ca2+測量
檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結合時不發熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內，被細胞內酯酶水解后并與胞內游離鈣結合后發出熒光。Kd值為Ca2+解離常數，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,
Kd和很多因素有關，如pH、 Mg2+、與蛋白的結合、溫度等。細胞內生理Ca2+濃度值(10-100n
M)，細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
熒光探針 激發波長 發射波長 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM
相對 測量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+濃度絕對測量
單波長公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 細胞內無鈣時的熒光強度( MnCl2)
Fmax：細胞內鈣飽和時的熒光強度(A23187)
測量時切記細胞內靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低（F值不低于40）
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
標準曲線法：根據儀器條件和負載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA- Ca2+)做標準曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強度
比例熒光的測量：雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2
細胞器的Ca2+測量
1.線粒體內游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）
2. 特異定位的重組水母發光蛋白 水母發光蛋白與 Ca2+結合后發藍光
用含有水母發光蛋白和含有特定細胞器蛋白的表達載體轉染細胞，可測定亞細胞器內的游離Ca2+變化
目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內質網、細胞核內的游離Ca2+，因生物發光很弱不能使用Confocal檢測
細胞內游離Ca2+測量的應用：
鈣的特性
1．細胞內外的電化學梯度103-104倍
2．細胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導致胞內鈣明顯升高
3．細胞內鈣為細胞激活“開關”
細胞內鈣的生理作用
1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯
2．神經遞質的釋放
3．學習記憶的增強
4．卵子受精
5．細胞分裂和再生
6．細胞調亡
7．細胞間通訊
8．細胞信號傳導
9. DNA合成
10. 基因表達
細胞內鈣超載與疾病
1．高血壓、腦缺血、心臟病、內分泌病—胞內鈣濃度異常
2．糖尿病、風濕性關節炎、多發性硬化病—胞內鈣濃度增高
3．人體缺鈣—骨鈣大量丟失，神經細胞的鈣濃度增高
4．老化和老年性癡呆-神經細胞內鈣濃度增高
細胞內生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M），細胞內Ca2+超載濃度值（基礎Ca2+濃度的10倍左右）
八.熒光漂白恢復(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定義:經熒光探針標記的細胞的某一區域一旦被高強度的激光照射后,熒光物質的光化學結構被迫壞,熒光強度下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強度會漸漸恢復, 熒光強度和恢復的快慢和多少,代表周圍分子擴散的速率, 或分子運動速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-熒光漂白恢復率：代表分子的運動速度
應用：細胞間通訊， 細胞膜流動性，蛋白分子的運動
九.籠鎖解籠鎖的測量
定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為解籠鎖。
籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經遞質、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等
十．熒光能量共振轉移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量轉移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。
能量共振轉移：分子可以看作為正負電荷分離的一個偶極子，受激發以一定的頻率振動，如果其附近有一個振動頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉移到后者，這種能量轉移稱為共振轉移。
熒光能量共振轉移的條件
兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm，供體的發射波長與受體的激發波長一致
檢測：
以FL1的激發波長的光照射樣品，沒有共振轉移時，只檢測到 FL1的發射光(綠光)，發生共振轉移時，就可檢測出FL1的熒光(綠光)減弱，FL2(紅光)的增強。
應用：檢測大分子的相互作用
大分子構象的改變(蛋白)，例：大分子(亞基)的結合與分離
受體與配體的結合 ，常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
十一 .其它應用
生物材料,例: 細胞在生物材料中的生長狀態及分布
激光掃描共焦顯微鏡的發展趨勢：
連續光譜型Confocal
多光子激光掃描顯微鏡