豬肉是國人主要的動物蛋白源, 年消費量為 5380 萬噸(2013), 約占世界年消費量的 50%[1]。但在 豬飼養業中存在大量的問題, 其中與肉品質相關的 有 PSE(pale, soft and exudative,指表面松軟、多汁、 色澤灰白的肉)、DFD(dark, firm and dry, 指暗紅色、 質地堅硬、表面干燥的肉)等, 每年因此而導致巨大 的經濟損失, 故快速、精確地鑒別 PSE 肉, 預防 PSE 肉等劣質肉的產生是豬飼養業急需解決的問題。目前 大多是通過豬肉的物理特性(如 pH、感官檢測等)或 幾個單質蛋白特性來鑒別 PSE 肉, 基于系統觀點以 混合蛋白為研究對象的方法報道極少。但目前的眾多 實驗現象表明, 僅用幾個食品組分來表征食品的整 體性質是不可行的。
首先, 生鮮食品是一個非平衡態, 它的各種性質在時空的變化是多尺度的[2,3]; 同時, 食品的組分數多達幾百個甚至更多, 且各組分間通 常都存在較強的相互作用。如何通過有限的幾個物理 化學指標來標示食品的品質是食品科學一直在探討, 同時也是亟待解決的問題。 第一個對光散射做研究的是英國劍橋大學的 J. Tyndall, 他提出了 19 世紀氣象學的兩大謎題: 為什 么天空是藍的? Tyndall 的同事 L. Rayleigh 成功地解 釋了這兩個謎, 得出著名的 Rayleigh 定理。隨后, Debye 首次將光散射理論應用到高分子溶液中, 得出 著名的 Debye 方程[4]; 1948 年, Zimm 在一張圖上將角 度和濃度同時外推到零, 提出著名的 Zimm 作圖法。 從此, 光散射技術成為一種應用于高分子溶液的經 典方法。 現代光散射技術包括動態光散射和靜態光散射 兩種。一般條件下, 光照射下溶液中的光散射粒子的 電子不會發生能級躍遷, 因此散射光與入射光兩者 頻率相同, 故激光光散射一般不考慮能量的轉移, 僅 研究散射光強度及其角度對溶質濃度依賴性的關系。 通過測定時間平均散射光強的角度和濃度的依賴性 能夠精確地得到高聚物的重均分子量 Mw、均方根旋 轉半徑(Rg 2 ) 1/2 和第二維里系數 A2 [5], 提供散射體的 大小和形狀, 以及有關熱力學特性等散射介質的特 性。
實際上, 介質中的質點或分子在不停地做布朗運動[4,6], 從而引起多普勒效應, 使得散射光的相位隨 入射光頻率發生變化, 這就是所謂的動態光散射[7], 又稱為時間相關的光散射, 即測定光強隨時間起伏 的變化規律[8]。它主要用于研究粒子的動態行為, 進 行動態光散射測定時, 利用快速時間相關儀記錄散 射光強隨時間的漲落即可得到散射光的特性衰減時 間, 進而求得平動擴散系數 D 和與之相對應的流體 力學半徑 Rh。同時, 光強的時間相關方程和溶液的粘 彈性緊密相連, 并用來定量地測得溶液的流變特性。 由于該方法無需外加力場, 且用溶液中的納米或微 米顆粒為探測子, 因此可用來探測溶液中細微結構 (尺度和決定該結構的力)。該方法叫微流變技術[9]。
目前, 光散射技術已廣泛應用于高分子、聚合 物、陶瓷、染料、硅膠、醫藥、表面活性劑體系(膠 束)、脂質體、蛋白與多肽體系等領域, 它不僅測定 范圍寬(從幾納米到幾十個微米), 并且具有快速、簡 便、分辨率高、重現性好、對樣品無損等優點。Saber Trabelsi 等利用動態光散射技術研究了在不同 pH 條 件下長鏈聚合物與不同個數的球狀蛋白結合前后, 其動態行為的改變[10]; Lorber 等[6]通過動態光散射技 術研究了溫度、溶液黏度和分子間相互作用力的變化 對粒徑大小的影響。 本文利用光散射技術測量豬肉總蛋白溶液的理 化特性參數, 由于該參數是由各種蛋白的相互作用 決定的, 因此, 它是一個食品品質的全局參數。本研 究一方面證明該參數可用來標定肉的品質, 并以此 為典型案例, 能推廣激光光散射技術在食品科學— 特別是食品蛋白物化特性方面的應用, 為食品質量 安全檢測提供一種新的方法。
2 材料與方法 2.1 材料與試劑 豬肉樣品取自杭州某屠宰場的杜長大(100 kg 左 右)肥育豬, 第 5-6 腰椎間背最長肌, PSE 豬肉(由顏 色、pH 及表面滲出判斷)樣品部位相同。宰殺后 6 h 以內, 用碎冰保藏并于 2 h 內迅速轉移至實驗室, 切 成 100 g 左右的小塊, 裝于二層聚乙烯薄膜袋中, 置 于?80 ℃超低溫冰箱冷凍保存。 磷酸氫二鈉, 磷酸二氫鈉, 氯化鈉, Tris, 檸檬酸,檸檬酸鈉, 鹽酸等所用試劑均為分析純, 購于杭州市 捷程試劑有限公司; 實驗中所配溶液用水均為來自 于 Thermo Scientific 的超純水(電阻=18.2 M)。 2.2 儀器與設備 絞肉杯(JYL C020), 九陽料理機; 高速冷凍離心 機(D-37520), 德國 KENDRO 公司; AR2140 電子天平, 美國 OHAUS公司; 真空冷凍干燥機 (FD-1C-50), 北 京博醫康實驗儀器有限公司; ALV/CGS-3 一體式激 光散射儀, 德國 ALV 公司; Thermo 超純水儀, 美國 THERMO 公司; Testo 206-pH1 便攜式酸度計, 德國 TESTO 公司。
2.3 方 法 2.3.1 豬肉總蛋白的提取 豬肉總蛋白的提取參考了 Tan 等[11]的方法, 稍 作改動。將肉樣在 4 ℃的冰箱中解凍后, 剔除脂肪和 結締組織, 然后將豬肉樣用絞肉杯絞碎成肉糜, 再準 確稱取 20 g(準確至 0.0001 g)肉糜于 250 mL 燒杯中。 按樣品質量、pH 緩沖液體積、氯化鈉溶液體積 1:4:1 加入緩沖液和氯化鈉溶液, 在 10℃恒溫條件下輔之 以微速攪拌, 提取蛋白質 1 h。提取結束后再劇烈攪 拌 10 min(冰浴); 然后將燒杯中的物質轉移至離心管 中, 于冷凍離心機中離心 20 min(4 ℃, 2000 r/min)。 取上清液用 4 層紗布過濾, 濾液即為所需的豬肉總蛋 白溶液。將該蛋白溶液分裝于 50 mL 塑料離心管中, 并貯存于?20 ℃備用。 2.3.2 豬肉總蛋白溶液的制備 將提取出來的蛋白溶液裝入截留分子量為 3000 的透析袋中, 置于相應 pH 的蛋白提取緩沖液中, 于 4 ℃透析 18 h, 以除去蛋白溶液中的鹽離子; 將透析 后的蛋白溶液于真空冷凍干燥機中凍干成粉末狀, 測量前將該粉末重新溶解于相應濃度的 NaCl 溶液中, 于 4 ℃放置過夜, 以確保其充分水合, 以溶液中有沉 淀為宜。然后將充分水合后的蛋白溶液于高速離心機 中離心(4 ℃, 8000 r/min, 10 min), 上清液即為所需的 豬肉總蛋白溶液。 2.3.3 蛋白濃度的確定 由于在光散射測量過程中, 所測得光學信號來 自于兩部分: 觀察對象的熱擾動和環境的熱噪聲。為 提高信噪比, 在光散射測量過程中, 蛋白濃度有一定 的下限。在我們實驗室中, 環境熱噪聲的光強信號約 為 800 Hz, 因此來自于蛋白顆粒的光學信號應至少10 倍高于這一數值以得到滿意的信噪比, 我們設定 溶液的光散射信號應大于等于 10 kHz[12]。同時, 蛋白 濃度也有一定上限。對于靜態光散射, 由于測定范圍 為 Zimm 圖的線性區域, 因此沒必要太高。對動態光 散射來講, 應避免多重光散射現象。針對不同蛋白體 系, 在做光散射實驗前, 預先確定蛋白測試范圍[13]。 在本文中, 正常豬肉蛋白的濃度為 0.5 mg/mL~ 40 mg/mL, 即蛋白提取液原濃度到稀釋 40 倍。 2.3.4 動態光散射測定 2.3.4.1 溶液散射光強的時間變化規律測定 取蛋白原液及其合適倍數的稀釋液裝入經丙酮 淋洗過的光散射專用小管中, 測量角度為 90°, 溫度 為 25 ℃。進行動態光散射測試, 每次測試的時間為 60 s, 后暫停 600 s。該實驗從稀釋后立即進行直至持 續 24 h。 2.3.4.2 溶液中顆粒大小的測定 將蛋白原液及其合適倍數的稀釋液裝入已經丙 酮淋洗過的光散射專用小管后, 測量角度為 90°, 溫 度設為 25 ℃, 進行動態光散射測試。每次測試時間 為 60 s, 每個樣品重復測量 3 次, 該實驗從稀釋后立 即進行。 2.3.5 靜態光散射測定 取蛋白原液及其合適倍數的稀釋液裝入已經丙 酮淋洗過的光散射專用小管中, 溫度設為 25 ℃, 測 量角度從 30°旋轉至 150°, 進行靜態光散射測試。每 次測試 30 s, 每個樣品重復測量 3 次, 該實驗從稀釋 后立即進行。 3 結果與分析 3.1 正常豬蛋白溶液的光散射測量結果 由于散射體積由入射光束和觀察散射光強用的 光學光闌的交叉部分決定, 因此主要依賴于散射角。 在光散射實驗中, 檢測到的散射光強必須歸一到恒 定的與散射角無關的散射體積中, 方法是以 sinθ(θ 為 監測器與入射光的夾角)因子進行校正[4]。因此, 當溶 液中散射顆粒為小尺度時(≤?/64,??為光散射試驗中 的激光的光波長 632.8 nm), 散射光強 I 隨入射角度 q(波向量, 4πn sin( ) 2 ? ? ? , n 為溶劑的折射率)呈現類似 于正弦函數的關系曲線[15], 如圖 1 所示。但圖 2 顯示, 對于正常豬肉蛋白溶液, 無論是在低鹽還是高鹽條 件下, 其 I 均隨 q 近似呈指數關系, 與小尺度分子條件下的結果相比具有顯著差異。由此我們推測, 在實 驗條件下, 正常豬肉蛋白溶液中均含有大尺度的結 構存在。同時由圖 3 可知, 隨著蛋白溶液存放時間的 延長, 正常豬肉總蛋白溶液的散射光強逐漸增大。根 據散射光強 I∝cR6 (c 為散射顆粒的濃度, R 為散射顆 粒的粒徑) [15], 散射光光強得增大可能是由溶液中顆 粒粒徑增大以及溶液中的散射顆粒濃度升高造成的。 但經過粒徑的測定, 其貯存過夜前后基本沒有發生 改變; 并且溶液中單體與聚合體濃度, 經過計算, 也 沒有發生顯著變化, 因此散射光強的改變可能歸因 于在蛋白質溶液, 豬肉蛋白分子結構在過夜過程中 發生變化, 使得它的折射系數與溶劑的差值變大, 從 而使得溶液散射光的光強增大[14]。 該結果還顯示該食品蛋白處在非平衡態, 它的 狀態隨時間變化, 即在食品中存在多空間和時間尺 度的變化, 和引言中的結論相吻合。 3.2 溶液環境對正常豬肉顆粒特性的影響 如圖 2 所示, 在豬肉蛋白溶液中, I-q 的相互依賴 關系符合指數方程, 我們將該指數定義為該物系的 分維系數 df, 它反映了溶液中粒子結構的緊密度 (compact)。同時, 還能從中獲取該結構的形成是由化 學反應還是擴散控制的[15]。低鹽條件下(0.1 mol/L), 隨著 pH 的增加, 正常豬肉總蛋白的分維系數逐漸減 小, 這說明 pH 對正常豬肉總蛋白的結構有著顯著的 影響, pH 的升高將導致溶液中散射粒子的緊密度降 低。這非常容易理解, 隨 pH 增大, 離蛋白的 pI(5.0 左右) [16]越遠, 蛋白所攜帶的電荷增多, 使得分子間 的相互作用變大, 蛋白的多肽不容易靠近。高鹽條件下(0.5 mol/L), pH 4.0 時其分維系數最大, pH 6.5 和 pH 9.0 時兩者的分維系數幾乎沒有改變(見表 1), 即 在該兩種 pH 條件下, 蛋白結構基本沒有發生改變, 但與 pH 4.0 時的蛋白結構有顯著差異; 同時, 相同 pH 條件下, 低鹽與高鹽條件下總蛋白的分維系數沒 有顯著變化。這一結果表明, 決定溶液蛋白相互作用 的主要作用來自于雙電層力, 而由于離子氛導致的 屏蔽效應及吸附在粒子上的離子在不同粒子間的相 互關聯作用是較弱的。同時, 由于離子屏蔽效應, 在 高鹽條件下, pH 6.5 和 pH 9.0 時蛋白分子的雙電層力 無顯著變化, 使得 df 變化不明顯。正常肉和 PSE 肉顆粒特性的比較 從上述實驗結果, 我們不難看出, 激光光散射技術利用 I-q 圖能分辨出豬肉蛋白溶液中的微小變化, 如蛋白分子攜帶的電荷變化, 游離離子的屏蔽效應 等。同時, 在整個測試過程中, 所需的溶液量少, 測 試時間短, 不直接接觸溶液, 這些特點使得激光光散 射技術有成為快速食品檢測技術手段的可能。為驗證 此可能性, 我們用該技術測試 PSE 肉的蛋白溶液, 并 和正常肉作比較。
由圖 4 可知, 不同溶液環境條件下, 正常豬肉總 蛋白溶液隨著稀釋倍數的增加, df 變化范圍見表 2、 表 3, 在濃度為 10~200 μg/mL 范圍內時尤為明顯。這 歸咎于在稀釋過程中, 蛋白分子結構發生變化。當結 果在 0.1 mol/L NaCl 和 pH 4.0 時, 蛋白溶液稀釋 20 倍和 50 倍, 散射光光強變化很小。這一實驗結果進 一步證實了原先的假設: 在蛋白溶液中存在超分子 結構, 并且, 此結構隨著蛋白溶液的稀釋會發生改 變。如果不是這種情況發生, 隨著溶液的稀釋, 散射 光光強將明顯降低, 特別是在我們的實驗條件下, 蛋 白濃度降低了 2.5 倍(如無其他物理化變化發生, 僅 是稀釋效應), 對應的散射光光強也要降低 2.5 倍左 右(此時的蛋白濃度很低, 分子間相互作用可忽略, 散射光光強由蛋白分子顆粒濃度決定)。同時, 當 NaCl 濃度為 0.1 mol/L 時, 隨 pH 的升 高, 正常豬肉 20 倍和 50 倍蛋白稀釋溶液的 I-q 線有 明顯變化(見圖 4、表 2)。在 pH 4.0 時, 如前所述, 幾 乎無差異; 但 pH 6.5時, 兩個溶液的測量值有非常明 顯的差異。而在 9.0 時, 差異達到最大。這一結果說 明, 隨著 pH 升高, 蛋白分子攜帶的電荷數增大, 形 成的超分子結構就越不穩定。在同樣的稀釋條件下, 超分子結構就越容易發生變化, 使得 I-q 的實驗結果 圖呈現明顯差異。如前所述, 蛋白溶液存放過夜, 散射光光強升 高, 反映出在存放過程中蛋白分子的結構持續變化。
由圖 5 和表 4 可知, 在相同實驗條件下, PSE 肉 蛋白的 I-q 圖形與正常豬肉的有差異。如在 0.1 mol/L NaCl pH4.0 時, PSE 肉蛋白溶液在放置過夜后, 它的 光散射光強隨波矢的變化和稀釋 5 倍條件下的僅有 微小差異。其背后的機制, 目前還在探索中。基本假 設是由于 PSE 肉的蛋白組成和正常豬肉的不一樣, 較多蛋白存在部分變性[17], 這使得與正常豬肉相比, 蛋白溶液中的超分子結構以及決定它的結構的物理力有很大差異。但 10 倍稀釋溶液卻呈現出一個明顯的 下降, 這有可能表明在 PSE 肉的蛋白溶液中, 當蛋白 濃度稀釋到一定程度時, 該超分子結構能很快被破 壞。總體來看, 與正常肉蛋白溶液相比較, PSE 蛋白 原液的過夜放置產物, 其 I-q 線與稀釋 5 倍的蛋白液 的 I-q 線更靠近。這和我們前面的假設豬蛋白變性對 超分子結構影響是相一致的。從圖 4 和圖 5 可看出來, 利用 0.1 mol/L NaCl pH 4.0 的提取液, 對正常豬肉和 PSE 肉的蛋白進行提取, 所得溶液用激光光散射技術測量 I-q 的依賴性, 能準 確快速的分辨出豬肉的品質。
4 結 論 本文從正常豬肉總蛋白入手, 通過激光光散射 技術對不同溶液條件下(pH 和 NaCl 鹽濃度)I-q 的依 賴性進行測定, 得出 pH 和鹽濃度都會產生一定的影 響(如表 1 所示): 無論在低鹽還是在高鹽條件下, 其 分維系數 df 均隨 pH 的升高而減小, 且相同 pH 條件 下, 0.5 mol/L 條件下的分維系數要略小于 0.1 mol/L 條 件下。因此, I-q 圖能非常敏感的揭示出蛋白分子相互 作用變化, 溶液中是否存在超分子結構, 該結構的大 致幾何特征, 以及該結構受哪種物理力的影響最大。另外, 通過比較 PSE 豬肉和正常豬肉總蛋白的 I-q 圖形特征, 我們發現 PSE 肉蛋白溶液確實和正常 豬肉有明顯差異, 由于分維系數 df 與溶液中顆粒的 結構[18]有關, 相同溶液環境中, PSE 蛋白和正常豬肉 蛋白的 df 具有差異性, 說明兩者蛋白分子具有明顯 差異, 這和文獻報道的 PSE 肉蛋白分子有部分失活 變性[19,20]相一致, 并在比較過夜放置溶液和不同稀 釋倍數溶液的圖形中再次得到印證。在 0.1 mol/L NaCl 和 pH 4.0 的提取液中, 兩類蛋白溶液的 I-q 圖形 有非常明顯的差異, 因此激光光散射技術有潛在可 能作為快速評價鑒定豬肉的技術手段。它具有用時 短、用量少、樣品無損且指標差異顯著等優點, 同時, 它的測量結果來自于儀器, 避免了人為因素在品質 鑒定中的干擾。 目前, 我們正對 PSE 和正常豬肉蛋白的 df 差異 作進一步的機制研究, 并和其他常規的分析方法作 比較, 測定該方法的可靠穩定性, 以及在測量過程中 的干擾因素, 優化和確定該操作流程, 以實現光散射 技術成為生鮮肉制品行業中一種新的快速檢測技術。