點突變不易擴增突變系統（簡稱ARMS)分析實驗

正常 ARMS 引物突變 ARMS 引物共 同（普通）引物

4dNTP10 X PCR 反應緩沖液已知基因型 DNA 模板輕礦物油Taq DNA 聚合酶loading緩沖液DNA 分子大小標記DNA 樣本

Perkin-Elmer Cetus thermal cyler (480 或 TC ) 和合適的反應管

基本方案 ARMS 試驗檢測單個突變

1.根據已介紹的 ARMS 引物指導欄，設計正常的、突變的和共同的 ARMS 引物以適合相應的突變。選擇一個合適的參照引物，由此獲得所有的引物并準備 50 umol/L 的各種溶液。

2.根據表9.7.2的指導方法準備正常和突變的 ARMS 反應體系，配40 ul預先混勻的反應體系至反應管中用于一個循環，如有必要可在室溫放置幾天或-20°C凍存幾個月。

3.室溫下加 5W已準備好的 10~50 ng/ul 對照DNA至每含有N和M混合引物的管中。

如有可能，分別建立含正常、雜合、純合個體的 DNA作對照，包括一個沒有加DNA 的含N和M管的空白對照。

4.加一滴石蠟油至每管中并蓋緊，IOs高速離心。

5.加12.5ul 10XPCR反應緩沖液以稀釋Taq DNA 聚合酶并加5 ul Taq DNA 聚合酶(5U/ul為最終濃度）至107.5 ul 無菌水中（足夠10次檢測），用移液槍混勻。

6.將PCR管放置熱循環孔中，94°C孵育5 min后，以最短時間拿走并移至另一管中并加5 ul Taq DNA聚合酶，稀釋至低濃度并覆有一層石蠟油，再放回94°C空白孔中。

重復此步驟，直至酶加入所有管中。

7.停止94°C程序并立即運行以下擴增程序：

35個循環：
1min 94°C(變性）

1min 60°C(退火）

1min 72°C(延伸）

1個循環

10min 72°C(延伸）

室溫保存一周。

如使用PaKin-ElmerCetus9600進行快速熱循環，其制造者要求改變循環次數以適合這類型機器的特點。

在擴增程序完成后，建議停止反應后應使孔中溫度降至50°C以防止人為產物產生。

8.準備3% 瓊脂糖膠使用4.5 g Nusieve’:agarose 3:1的比例，和1 X TBE含 0.5 ug/ul 乙啡啶溴化物緩沖液 150 ml(足夠10次反應）。

9.標記一個0.5 ml微型離心管，另加10 ul 上樣緩沖液至每管。

10.最好在無蓋管在有蒸汽罩或隔離的實驗室，以避免含有 ARMS 產物懸浮微粒，從石油油層下吸取25 ul ARMS 反應物至相對應的標記好的管中，并用移液槍混勻。

11.每個膠泳道點樣20jul產物，包括DNA分子標記，電泳時間為1~2 h，電壓120 V; 紫外線下照射成像。

12.按照引物（A和B、C和D或E和F)，分析每個泳道的預期大小及ARMS片段(對照片段大小分別應為360bp、813bp或825bp)。正常和突變的 ARMS產物有3個可能的結果：

所期待的結果。目的等位基因存在于樣本中時，沒有可見產物則目的等位基因缺失。

非特異性結果。ARMS有產物，目的等位基因存在于樣本中；當目的等位基因缺失時，ARMS產物仍可見。

非敏感性結果。ARMS產物缺失或即使目的基因存在也很微弱；等位基因缺失時沒有可看見的產物。

（1）如果從正常和突變的ARMS 引物中可獲得期待的結果，那么優化條件已完成。ARMS 檢測即可準備使用——省去第 13~14 步進行第15 步。

（2）如果有一個或兩個ARMS引物是非特異性的，則進行第13a步。

（3）如果有一個或兩個ARMS引物是非敏感的，則進行第13b步。

對于非特異性的ARMS引物

13a.增強反應特異性，用兩套反應體系重復方案中第2步，分別用 2~5倍。

14a.如非特異性條帶仍可觀察到，在此末端堿基中增加錯配的長度（表9.7.3)重復第1步。

對于非敏感性的ARMS引物

13b.用兩套反應體系重復第2步增強敏感度，在兩種反應混合物中分別用2~4倍 ARMS 引物數量或減少對照引物濃度。

14b.如所期待的ARMS產物條帶仍然很弱或缺失，在此末端堿基中減少錯配長度，根據表9.7.3重復第1步。

在特異和敏感的ARMS 反應中改變一條ARMS引物中額外的錯配常引起一個大的改變，改變引物濃度有小的影響并可優化反應。

隨后使用已知基因型DNA樣本優化ARMS試驗，要求先配制大批量的ARMS 反應體系，再分裝，各自的ARMS反應體系能穩定保存在-20℃至少6個月。

15.實驗操作中優化的反應條件中所獲得的信息去分析DNA樣本；樣品來自第2~12步。如有可能，包括兩個空白（無DNA)和對照（已知基因型）樣本，如果發生問題，則參考表9.7.4。

備選方案 多種 ARMS 致多重突變的分析

常有必要分析一個特別的基因的幾種不同突變點的存在或缺失，一個選擇則將實施一系列單個ARMS檢測；在這個流程中可選擇的方法將再進行多重ARMS檢測。

單個ARMS檢測中大多數變量被標準化，并且引物序列和濃度改變以獲得期望的結果這種方法同單個ARMS檢測相同。原則的區別是有幾對混合引物同時被優化，增加了程序的復雜性。從增加的復雜性看來，在多重ARMS檢測的發展中不可能概括同水平的程序。在單一檢測的發展上程序的基本步驟是一樣的，但也有以下的不同。

1.一般，相較于單一的ARMS檢測，在多重ARMS檢測中使用不穩定的錯配對較少，用表9.7.1(錯配對的選擇）及表9.7.3(錯配長度）以選擇較少的不穩定錯配。

2.在反應中不同的ARMS產物是有基本大小差別的。最好設計ARMS產物大小有>50bp 的差別。在相同的實驗中有必要使用一個 PCR 擴增較大片段產物的對照；在寡核苷酸鏈引物中列出可選擇的兩個程序（參見附錄中對照引物配方）。

3.合并幾種ARMS反應成兩重反應體系。除去正常和突變的反應，則兩個多重反應包含一些反應體系和其他突變的ARMS引物和正常 ARMS引物。

4.用于檢測常染色體的隱性遺傳疾病基因，如果同時分析至少四種突變并且兩個反應管包含至少兩個正常特異性的ARMS反應，則 PCR 對照反應能省去。

5.如果多重檢測是在同樣的外顯子相鄰位置的幾個突變時，則有可能使用許多 ARMS引物中的單一的共同引物。

6.多重程序和單一的 ARMS 檢測一樣很重要，除了或許有必要重復全過程（第1~15步），因為同時要優化幾個擴增的反應體系。

支持方案 口腔和血液樣本中 DNA 的快速提取法

以下的步驟描述一種口腔和血液樣本中 DNA的快速提取法以提供適合這個單元里描述的ARMS反應條件的 DNA。

舳提血液 DNA

1a.加 800 ul 現配的170 mmol/L 依酚氯銨至裝有 200 ul 血液的 1.5 ml 離心管中，振動器上混勻 20 min，高速離心 2 min 以獲得細胞團，除去上清液。

2b.用 300ul 的 10 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 洗細胞團，高速離心 15s。重復洗 3 次以除去可見的血紅蛋白。

抽提口腔樣本中 DNA

1b.在口腔中劇烈振蕩 10 ml 4%（m/v) 蔗糖水 20 s 以產生含有上皮細胞的懸浮液。用 25 ml 無菌塑料樣本管收集懸浮液。室溫中 1200 g 離心 10 min 獲得細胞。除去上清液。

為避免任何潛在的污染問題，要求收取上皮細胞懸浮液前 30 min 時，禁用食物和飲料。

2b.加500ul 10 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 再次懸浮細胞并移至離心管。高速離心 15s 并除去上清液。

3.用 500ul 的 50 mmol/L NaCl/lO mmol/L EDTA 重懸細胞團并旋轉 Ios 以重懸白細胞團。無菌水孵育 20 min。

4.加 100 ul 的 1mol/L Tris·Cl 中和并旋轉 5s。

5.高速離心 15s 除去細胞屑。-20℃ 保存上清液（5ul 包含約 100 ug DNA，足夠一次 ARMS反應）直至使用時。