煙草中多種添加物的鑒定

德國柏林Charite法醫研究所的科學家們會同瑞士同行一起，研究了如何對香煙中范圍寬廣而化學性質各異的不同物質進行有效的檢驗。閱讀本文之后，您就會知道為什么要決定采用氣質與頂空固相微萃取GC/MS HS-SPME相結合的分析方法。

煙草是允許含有添加物的。根據煙草產品的管理規定，甚至可以添加多達數百種物質，其中包括糖（Glycole）和蟲膠作為粘合劑，氯化鋁（氯化銨），還有濃縮甘草汁、可可、茶葉、咖啡，以及保濕劑，例如甘油或者丙二醇等。

中立的科學家們指出，有幾種添加物可能導致香煙潛在毒性的提高。它們可以直接影響尼古丁的吸收，從而強化煙癮。其中有幾種芳香化合物會燃燒形成有毒的反應產物。“這僅僅是可能釀成的后果而已”，Fritz Pragst教授認為，“立法人員要對這些添加物另外作出決定。”柏林Charite法醫研究所毒物學研究人員與該所Careen Pietsch博士以及瑞士同事們一道，發展了一種分析方法，可以用來對香煙中89種重要的添加物進行有效和靈敏地測定。

選用樣品預處理方法

為了鑒定香煙中的添加物，根據其特性采用了與適當的檢測器相結合的氣相色譜方法。鑒于復雜的煙草基體和添加物的化學多樣性，在樣品預處理時不可能采用通用的靈丹妙法。

圖1 某香煙樣品的總離子色譜圖。應用HS-SPME 和 GC/MS方法進行測定。（采用SPME-纖維有65μm CW-DVB, 65μm PDMS-DVB, 100μm PDMS 和85μm PA, 使用前經堿處理。）

Pragst教授認為：“常規的方法諸如蒸汽蒸餾法、溶劑萃取法、捕集吸附法或者上述技術的聯合都顯得工作強度過大。而且由于所加入的添加物的濃度很小，方法的靈敏度也不能滿足要求。”

與此相反，頂空固相微萃取HS-SPME方法已被成功地應用于大多數樣品基體中對具揮發性和難揮發性的物質進行GC/MS分析前的樣品預處理和進樣過程之中。該法操作簡易，而且還減少了溶劑的使用。柏林的科學家們確定：“這種HS-SPME方法還能夠采用一種唯一的不用溶劑的步驟，對樣品進行采樣、萃取、濃縮和完成進樣。”

專業文獻中已經大量報道過將HS-SPME方法用于煙葉和香煙分析。“可是大多數情況下方法僅限于為數不多的幾種物質，例如有機酸、烷基苯、香豆素、胡椒醛、長葉薄荷酮以及C1–C4的醇的乙酸酯，或者僅限于調味添加物。多元酚則采用HPLC和電噴霧離子化-質譜法進行檢測”， Pragst教授這樣總結道。

尋找合適的分析方法

由于香煙的添加物在化學性質上各不相同，有的為堿性，有的為中性，還有一些為酸性。所以不能指望將所有這些物質僅憑唯一的一次氣相色譜分析過程全部加以檢出。如果要實現這一目標，只能是開發一種掃描的方法，借助有限的測量次數，將香煙中所用的盡可能多的添加物進行靈敏地測定。為實現這一任務，需要一系列專家的共同努力。柏林Charite法醫研究所的毒物學研究者們為此必需找出一種方法，運用那些HS-SPME纖維可以在寬廣的范圍將盡可能多的不同極性的化合物萃取出來。Pragst教授說：“從檢測的物質的數目和信號的強度以及峰形來看，最佳的結果是采用CW-DVB-纖維取得的。”這種選擇是通過對一些按照堿性、中性和酸性預處理的組分在其SIM-模式測量中所產生的峰面積進行比較來加以證實的。由Supelco公司提供的毛細管氣相色譜柱PAT-5獲得了最好的結果。這是一種經過特殊處理、基質去活了的聚合柱（5%二苯基/95%二甲基硅烷），原本用于分析胺類以及其它堿性溶質。

科學家們制備了不同pH值的樣品溶液。所用的香煙選自55種不同的包裝和32種品牌。在分析時間和萃取結果之間，選擇了在95℃ 吸附15 min作為折衷方案。 為考察煙葉用量對于HS-SPME方法的影響，采用了加入2，6-甲苯作為定量分析的內標物質。

圖2 某市售香煙的總離子色譜圖，應用HS-SPME 和 GC/MS方法進行測定。樣品預處理方法：（a）堿性，（b）中性，（c） 酸性（峰1 – 89 排位情況見 Journal of Chromatograohy A,1116(2006) 10-19）。

Pragst教授說：“實驗表明：隨著煙葉量的增加，2，6二甲苯的峰面積強烈降低。”甚至對于其他組分，如2-乙基-1-正己醇或者吲哚在煙葉量增加的情況下，也能確定峰面積變小。究其原因可歸結為有限的纖維容量效應。色譜圖顯示出高強度的基線背景，因而，在檢測較小的信號時，不能得到足夠的靈敏度。實驗表明，采用50mg樣品量時為最佳。

實際樣品的應用

由柏林Charite法醫研究所研發的這種HS-SPME GC/MS方法已被用于大量香煙品牌的研究中。為了進行比較，采用了不同的煙草原料和兩種加入了不同添加物的香煙來進行。采用同一種品牌和批次的大量香煙經混合和勻質化而制備的代表性樣品則沒有進行分析。未曾料到的是，所進行的定性和定量的雙份檢測結果顯示出同樣的加合特性。Pragst教授證實：“在單一的一支香煙和一包香煙之間所產生的濃度差別小于20%。”

對于每種香煙，都要采用雙份的HS-SPME GC/MS方法對其堿性的、中性的和酸性的樣品懸浮液進行分析。質量掃描在m/z= 45~400范圍內進行，每一個峰都要采用Wiley 和NIST數據庫進行對照。Pragst教授進一步指出，采用他們自己研發的數據庫可以更好地分析所得到的譜線。為證實起見，將保留時間和質譜圖與相應的參考物質在相同條件下得到的數據來進行比較。

研究人員一共鑒定了89種重要的組分，其中包括天然的煙草成分，如尼古丁和其它的煙草生物堿以及一些在生產香煙時添加進去的調味品、保濕劑和蓬松劑。通過將市售香煙的色譜圖與參照香煙和煙草原料的色譜圖進行比較，就可以判斷哪些組分是純天然的，而哪些是人工添加進去的，其中揮發性乙醛和酯是在芳香、調味品和食品工業中經常添加的組分。Pragst教授認為：“γ- 壬烷內酯，屬于一種已知的椰子醛，以及γ- 十一烷內酯（桃醛），賦予甜蜜和濕潤的特性。薄荷和佐料的味道則是通過異胡薄荷醇、百里酚和薄荷醇產生的。甘油三乙酸酯、丙二醇或三聚丙二醇是作為輔料加入的，用作蓬松劑，賦予醚香油成分或作為煙葉濕潤劑之用。一次實驗中還發現了6-甲基豆香素， 一種人工合成的帶有甜味的椰子香精。”

定量分析保安全

薄荷醇、2-乙基-1-己醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙酮、吲哚、吡啶和糠胺本是天然存在于煙葉中的組分，但在生產香煙的過程中會部分損失掉。為保持煙草的原汁原味，這些組分也會作為添加物而加入。為了區別是天然成分還是添加物，進行定量分析是必要的。定量分析的結果證明了我們科學家的觀點是正確的。在香煙中發現的薄荷醇、2—乙基-1-己醇、苯甲醇的濃度明顯高于在煙葉原料中測定的數值。舉例來說，在某非薄荷醇香煙中測得薄荷醇的濃度要比煙葉原料中的薄荷醇高出100倍之多，比參考香煙也高出近40倍。在2-乙基-1-己醇也得到相似的結果，其濃度要比參考香煙的值高出170倍。

研究結果表明：HS-SPME 與GC/MS 和質譜數據庫相結合的方法可以成功地應用于香煙的例行分析中，對數量眾多的堿性、中性和酸性的香煙添加物進行掃描。由于香煙中大多數添加物為半揮發性組分，所以這種HS-SPME 預處理技術特別適用。另外，還應指出，這種方法通過定量檢測，可以檢驗香煙是否符合所規定的添加物的最大允許濃度，以及控制天然組分的人為添加量。