該技術進行改進后可以滿足上百個核苷酸序列的測序工作，這樣該技術又可以滿足對重要微生物的鑒定與分型，特定DNA片段的突變檢測和克隆鑒定等方面的應用。原理焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應。焦磷酸測序技術的原理是：引物與模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)4種酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的。焦磷酸測序技術的反應體系由反應底物、待測單鏈、測序引物和4種酶構成。反應底物為5’-磷酰硫酸(adenosine -5’-phosphosulfat，APS)、熒光素(1uciferin)。反應過程在每一輪測序反應中，反應體系中只加入一種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果它剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則會在DNA聚合酶的作用下，添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)。在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS結合形成ATP,在熒光素酶的催化下，生成的ATP又可以和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數成正比。如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一個堿基配對，則上述反應不會發生，也就沒有檢測峰。反應體系中剩余的dNTP和殘留的少量ATP在Apyrase的作用下發生降解。待上一輪反應完成后，加入另一種dNTP，使上述反應重復進行，根據獲得的峰值圖即可讀取準確的DNA序列信息。應用焦磷酸測序技術可以用來研究單核苷酸多態性(single ucleotidepolymor—phism，SNP)，遺傳多態性，植物多態性分析，分子診斷細菌與病毒分型、甲基化分析、法醫鑒定及藥物基因組學等方面都有廣泛的應用。