實驗材料 燕麥
試劑、試劑盒 乙醇蒸餾水Clorox 漂白劑
儀器、耗材 培養皿MSI 培養基
實驗步驟
1. 芽尖培養
( 1 ) 成熟的燕麥（Ogle、Pacer 和 Prairie ) 種子用于芽尖培養。
( 2 ) 徒手去除種子的外稃和內稃。
( 3 ) 種子用 70% 乙醇（Sigma) 浸泡 5 min 進行表面消毒，然后用無菌蒸餾水洗一次，再用 20% 的 Clorox 漂白劑浸泡，并在旋轉振蕩器上以 0.5 g 持續振蕩 30 min (VWR International, Bristol, CT 06011) (見注 1) ，用無菌蒸餾水洗二次。
( 4 ) 在無菌條件下將種子放入裝有濕潤濾紙的培養皿后，覆蓋一層濕濾紙，將培養皿在 3~5°C 放置 2~3 天以使種子適應處理條件。期間要經常加水保持濕度。
( 5 ) 放置結束后，將 10~12 粒經過消毒的種子放入倒有 MSI 培養基的（25 mL/每皿）無菌培養皿（100 mm x15 mm，直徑x高；VWR ) 中萌發，在生長室或 25°C 生長箱中暗培養一周（見注 2) 。
( 6 ) 種子萌發后，用無菌的刀片（Sigma) 將芽尖切成 3~5 mm 的小段（見注 3) 。
( 7 ) 將 5~7 個切好的芽水平放置在倒有 MS2 培養基的培養皿中（100 mmx15 mm ) ，在 25°C 持續光照條件下培養4 周 [ 60 μmol/( m2·s ) 采用 40W 功率的冷白光 Econ-owatt 熒光燈管，Philips Westinghouse, USA ] ( 見注 4 ) 。
( 8 ) 每周進行一次繼代培養，從培養的芽尖將伸長的葉片、胚芽鞘和莖移除，然后再切成 3~5 mm 的小段。
( 9 ) 每 2 周用 MS2 培養基進行繼代培養以保持叢生芽的生長 [ 圖10.2 (a ) ]。
( 10 ) 培養 8 周后計算每一品種叢生芽的相對分化頻率，即產生叢生芽的芽尖數與培養的總芽尖數的百分比（見注 5 ) 。
2. 微粒轟擊
( 1 ) 取 30 mg 金粉或鎢粉置于 1.5 ml 離心管（VWR) ，加入 1 ml 100% 乙醇髙速渦旋振蕩 30 min 進行消毒，用于基因槍轟擊。
( 2 ) 在振蕩過程中，取 50 μl 微粒乙醇懸浮液到新的離心管中，并用微量離心機(Brinkman, Westbury， NY 11590) 10000 g 離心 30s，然后加入 1 ml 蒸餾水，渦旋振蕩洗滌并離心。洗兩次后，用 332 μl 無菌蒸餾水重懸微粒。
( 3 ) 在重懸的微粒中加入 15 μl DNA 樣品，其中含有 15 μg 陽摩爾比為 1 : 1 的 pBY520 和 pActl-D 質粒、225 μl 的 2.5 mol/L CaCl2 (Sigma) 、50 μl 0.1 mol/L 亞精胺 (Sigma) ，室溫下渦旋振蕩 5 min (見注 6) 。
( 4 ) 將微粒- DNA 懸浮液在冰上放置 10 min，然后 10000 g 離心 1 min。
( 5 ) 用 500 μl 100% 乙醇清洗微粒-DNA 沉淀，渦旋振蕩 30s，離心 1 min，然后用 100 μl 100% 乙醇重懸微粒。
( 6 ) 根據大小將 2~3 個叢生芽放置在鋪有 MS3 培養基（25 ml/皿）的培養皿中直徑為 1.5 cm 的區域內，然后將培養皿放在基因槍的終止屏下方（見注7) 。
( 7 ) 吸取 10 μl 微粒-DNA 懸浮液加在載體膜（macrocarriers) 中心，待乙醇揮發后立即用于轟擊（見注 8) 。
( 8 ) 2 h 后對每一個芽尖培養物再進行一次轟擊（見注 9) 。
( 9 ) 將轟擊后的芽尖移到新鮮的 MS2 培養基上（25 ml/皿），在 25°C 持續光照 [ 60 μmol/( m2·s )] 條件下生長 4 周，期間進行一次繼代培養 [ 圖 10.2 ( b ) ]。
3. 轉基因組織的選擇
( 1 ) 4 周后，將基因槍轟擊過的叢生芽分成直徑 5~10 mm 的小塊（避免損傷芽分生組織），然后每皿放 6~8 個芽叢于 MS4 培養基上（25 ml/皿；100x15 ) ，并計算轉基因事件的相對發生頻率（表 10.1)。
( 2 ) 2 周后，將轉基因的芽（綠色的）在新鮮的 MS4 培養基上進行繼代培養，去除非轉基因的芽（黃色或褐色）。
( 3 ) 在 MS4 上選擇培養 4 周后，將綠色的叢生芽分成直徑為 5~10 mm 的芽叢，在 MS5（25 mL/皿，100x20 ) 培養基上繼代生長 4~6 周。
( 4 ) 經過總共 4 個月的選擇和增殖后，將快速生長的叢生芽移至帶有 MS6 培養基（50~70 ml/Magenta) 的 Magenta 盒（99 mmx 68 mm，長X直徑，Sigma；2~3 芽叢/Magenta) 中進行營養生長，然后移至 MS7（50~70 ml/Magenta) 培養基中進行生根培養 [ 圖 10.2 ( c ) ]。
( 5 ) 當轉基因植株長到 5~10 cm 高、有 2~3 個葉片時，移植到含混合土的 8 cm 塑料罐中，其中泥炭和珍珠巖按 1 : 1 混合，每罐一棵。在 16 h 光周期、70%~80% 濕度的溫室中生長直到成熟 [ 圖10.2 (d) ; 見注 10]。
( 6 ) 讓轉基因植株自花授粉結實，收種，按株系獨立保存在 4℃ 和 70% 濕度的環境中。