牛奶中β內酰胺酶檢測方法

　　“無抗奶”，顧名思義，即不含抗生素的牛奶。早在2002年，這一概念便被提出，“無抗生素”的字樣也登上了乳品包裝。

　　為何牛奶含抗生素？

　　牛奶中的抗生素來自乳牛，乳牛被注射抗生素，主要是治療乳腺發炎。乳腺炎是奶牛常見病，抗生素的使用是業內“公開的秘密”。牛奶中的抗生素可能導致飲用者過敏，或因長期接觸抗生素而耐藥。

　　如何做到“無抗”？

　　藥品合理間隔期后才擠奶，可以生產無抗奶，可以通過檢驗抗生素的方式驗證。

　　1、間接法

　　方法原理：利用β-內酰胺酶能夠酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內酰胺酶，那么青霉素經β-內酰胺酶酶解后濃度會減少，從而判斷牛奶中是否存在β-內酰胺酶。

　　實驗步驟：稱取20 g試樣，在4℃、16000rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，并將塑料離心管置于37℃水浴鍋中振蕩孵育30 min。向孵育后的離心管中加入無水乙醇15 mL。振蕩提取30 min后離心，將上層清液過濾紙后收集于梨形瓶中。減壓濃縮蒸發掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸鹽緩沖液（pH=8.5），渦旋1 min后調節pH為8.5。以1 mL/min的速度將提取液通過經過預處理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸緩沖液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脫。將洗脫液在40℃下氮氣吹干，用0.025 M磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）定容殘渣至1 mL,待上機測定。

　　色譜條件：LabAlliance PC-2000高效液相色譜配500型紫外檢測器；

　　 lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm)；

　　 流動相: 甲醇/0.004M 磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；

　　 檢測波長: 268 nm

　　2、直接法

　　方法原理：牛乳中的青霉素鉀在β-內酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸鉀，并伴隨生成少量的青霉胺、青霉醛等物質。經去脂肪、蛋白等前處理后，可以將青霉噻唑酸鉀提取出來，經高效液相色譜儀檢測確認其是否存在，從而判定該牛乳是否為人造“無抗奶”。

　　實驗步驟：稱取20 g試樣，在4 ℃、16000 rpm條件下離心10 min。取下層清液10 g于50 mL塑料離心管，加入無水乙醇15 mL，振蕩提取30 min后離心，取清液經0.45 μm的濾膜過濾，用高效液相色譜儀檢測。

　　標準溶液配制：稱取0.01 g（精確至0.001 g）青霉素鉀于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解劑，室溫放置2h使青霉素鉀酶解完全后用去離子水定容，得到青霉噻唑酸鉀標準溶液，濃度100 μg/mL。根據實際情況稀釋后使用。

　　色譜條件：LabAlliance PC-2000高效液相色譜配2000型紫外檢測器；

　　 lanbo色譜柱 :C18(4.6mm×150mm×5μm)；

　　 流動相: 甲醇/0.004 M磷酸二氫鉀（pH=4.5）＝40/60；

　　 檢測波長: 230 nm