特異性抗原誘導的細胞毒性T細胞功能測定

實驗概要

本方法先借助長期混合淋巴細胞培養法獲得抗原特異性CTL，然后再進行細胞毒試驗。其原理為：外周血淋巴細胞包含針對不同抗原的特異性CTL克隆，在體外經某一特定（或同種異體細胞）抗原刺激后，能識別該抗原的T細胞克隆被選擇性激活、增殖，而其他T細胞克隆則逐漸死亡；經3~4次刺激后，存活的均為識別特異性MHC/抗原肽復合物的細胞，即抗原特異性CTL  。

主要試劑

絲裂霉素C（Sigma）：用培養液或PBS配制300μg/ml

含20%的新生牛血清的RPMI 1640

實驗材料

EB病毒轉化的B淋巴母細胞株

實驗步驟

1.   特異性CTL的誘導和制備

1)   取作者外周血分離PBMC，無血清1640洗兩遍，用含20%的新生牛血清的RPMI 1640調成1.5×10⁶ /ml，置于24孔板中，于5% CO₂ 培養箱中4小時使單核細胞貼壁以去除之，然后收集細胞，計數；

2)   取EB病毒轉化的B淋巴母細胞，加入絲裂霉素C，最終濃度為30μg/ml，于37℃水浴中作用30min，1000r/min離心10min，棄上清，沉淀細胞用1640液洗滌3次并計數；

3)   取2×10⁶ 個PBL于24孔板中，加入5×10⁴ （2.5%）個經絲裂霉素C處理（30mg/ml、30min）的自身、同種異體（其HLA-I類型別完全不同）的EBV-LCL細胞作為刺激細胞，混勻，用完全培養基（RPMI 1640）補總體積至2ml；

4)   靜置于培養箱中；4d后半量換液，繼續培養3d；

5)   離心收集細胞，取1×10⁶ 個反應細胞，加入2×10⁵個（20%）的刺激細胞，第三天加入重組IL-2，使終濃度為30U/ml；每三天半量換液一次并維持相同IL-2濃度。

6)   每周按相同程序刺激效應細胞一次，3~4次后，效應細胞即為特異性CTL，可用于殺傷實驗。

2.   細胞毒試驗

檢測CTL細胞毒作用均可采用檢測NK細胞殺傷活性的方法，僅效靶細胞比例不一樣，現將LDH釋放法簡要敘述如下：

1)   靶細胞為用作刺激細胞的自身或同種異體EBV-LCL細胞，調成1×10⁵/ml；

2)   效應細胞為上述誘導的特異性CTL，調成2.5×10⁶/ml；

3)   各取0.1ml于96孔板中（效/靶比值為25:1）；輕輕吹打，使二者混勻；同時設靶細胞自然釋放對照組（即只加靶細胞而不加效應細胞）和最大釋放對照組（0.1ml靶細胞和0.1ml 1% NP-40）；

4)   1000rpm/min離心2min后，置37°C、5% CO₂ 培養箱中孵育4hr;

5)   酶促顯色反應：參見“NK細胞殺傷實驗”。