圖2. 單細胞測序繪制CD8+ T細胞獨特的基因圖譜及分析
進一步研究揭示，抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯合免疫治療介導形成獨特的腫瘤特異性CD8+ T細胞群
如圖3A所示，取經抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及兩種抗體聯合分別處理的荷瘤小鼠，在處理后的9天和12天，取瘤內T細胞，進行相關maker標記（PD-1、TIM3、LAG3、KLRG1，CD244和CD44），根據不同標記物的表達情況，繪制瘤內T細胞群。結果顯示，經抗GITR抗體，抗PD-1抗體與GITR抗體聯合治療后，抗原特異性CD8+ T細胞在T細胞的不同分化階段表現出一定的異質性。將各maker異質性細胞群密度圖整合分析，發現形成的14號12號和7號細胞集群對PD-1抗體和GITR抗體聯合治療具有高度響應，同時揭示14號細胞集群的出現預示T細胞功能障礙到達終點（早期并未形成14號細胞集群）（如圖3B-G）。
圖3. 抗體聯合治療后，對功能性障礙的腫瘤浸潤CD8+ T細胞群的鑒定
雖然經過以上研究，發現了腫瘤特異性CD8+ T細胞群，但這并不能說明PD-1抗體與GITR抗體聯合治療的長效性。
為了找到抗體聯合治療的長效性的原因，研究者們隨后對T細胞群進行表征分析，利用更多的T 活化與分化過程中的標志物對T細胞進行標記，做深度剖析（圖4A-B）。經SPADE集群分析顯示（圖4C-E），由抗GITR抗體驅動的免疫聯合治療12天后，瘤內出現了特殊的記憶性細胞群，此細胞群的形成標志著獲得性免疫的開啟，維持抗體聯合免疫治療的長效性（圖4F-G）。
圖4. 抗體聯合治療后，對記憶性CD8+ T細胞群的鑒定
到目前研究節點上，我們已經了解到，雖然PD-1抗體很少引起T細胞功能障礙，但卻不能保持免疫治療的長效性。而GITR抗體與PD-1抗體的聯合免疫治療中，瘤內出現了記憶性的CD8+ T細胞群解釋了先前研究者對聯合療法長效性的困惑。
在抗PD-1/GITR聯合療法中CD226廣泛表達在腫瘤特異性的CD8+T細胞群中
為了進一步研究抗PD-1抗體與抗GITR聯合療法協同作用于CD8+T細胞群的內在機制，科學家們開始對前文提到的CD226共刺激分子的表達進行深度研究。如圖5A所示，在經兩種抗體聯合治療后，CD226 mRNA在腫瘤內不同的CD8+T細胞群上廣泛性存在。進一步研究發現，經PD-1抗體治療的MC38小鼠模型，其脾細胞中的抗原卵白蛋白（OVA）特異性的CD8+T表達的CD226蛋白質最高，說明在抗腫瘤過程中，PD-1抗體的治療對驅動CD226表達的抗原特異性T細胞發揮了關鍵性的作用（圖5B）。