獨體—基于纖連蛋白類型Ⅲ結構域框架的抗體模擬 Akiko Koide and Shohei Koide實驗
實驗材料 pAS38pAS45pAS47
試劑、試劑盒 聚乙二醇（PEG) 氯化鈉溶液HEPES 緩沖液涂布溶液Tris 緩沖鹽水TBS-Tween-20瓊脂糖-磷酸溶液
儀器、耗材 LBSOCYT
實驗步驟
3.1 實物庫構建
我們用 Kunkel 突變技術構建大多數的實物庫雖然我們證明了 AB 鏈套可用來結合目標分子，但多數情況下，我們用 FNfn10 的 “上” 端（BC、DE 和 FG 鏈套；圖 6.1A ) 作為目標分子結合位點 [ 10 ]。我們的方法基于 Bio-Rad 的 Mutagene kit [17]。用大腸桿菌 SS320 做電轉化，可以很容易地制備含有大約 109 個獨立克隆的實物庫。
3.1.1 尿嘧啶單鏈噬粒的制備（用于單價噬菌體展示和酵母雙雜交篩選)
( 1 ) 用 pAS47、pAS38 ( 用于獨體-基因 III ) 或 pYT 45 (用于 B42-獨體）轉化 CJ236，在 LB- AP 平板中選擇菌落。
( 2 ) 把一菌落接種到 2 ml 2X YT-Ap-氯霉素培養基，37°C 搖動過夜。
( 3 ) 將 30 ml 補充了 0.25 μg/ml 尿苷的預熱 2X YT-Ap 培養基裝入 250 ml 規格帶凹陷三角燒瓶，用 300 μl CJ236 過夜培養液接種，再加入 1010 個/ml 輔助噬菌體 KO7( Promega)。在強力搖動下于 37°C 生長 2h。加入 Km 使終濃度達到 70 μg/ml。在強力搖動下于 37°C 生長過夜。
( 4 ) 于 4°C 以 12000 g 離心 [ 10000 r/min，用 SS-34 (Sorvall) 或等效的轉子 ] 10 min。將上清液移入新試管，再次以 12000 g 離心 10 min。將上清液移入新試管。加入 4.5 ml PEG/NaCl 溶液，并徹底混合。4°C 保育過夜。
( 5 ) 于 4°C 以 17200 g 離心（12000 r/min，SS-34 轉子）20 min。拋棄上清液將試管倒放在一疊紙巾上 1 min 。用紙巾擦去殘余液體。
( 6 ) 將噬粒沉淀懸浮于 1 ml TBS 中，并移入微離心管。在微型離心機上以最大速度離心 2 min。將上清液移入新微離心管。加入 150 μl PEG/NaCl 溶液，徹底混合。在冰上保育 30 min。
( 7 ) 在 4°C 以最大速度離心 10 min。拋棄上清液，稍加離心，并用移液器除去所有液體。將沉淀懸浮于 1 ml TBS 中。
( 8 ) 用 XL-1 Blue 和 CJ236 測定噬粒濃度。將 100 μl 新鮮大腸桿菌（600 nm 光密度 OD 值為 0.5~1.0 ) 和 10 μl 系列稀釋噬粒溶液混合。室溫保育 15 min，并鋪在 LB-Ap 板上。在 37°C 保育過夜。用 CJ236 的滴定值應該是 1012~1014 個/ml，并且應該比用 XL-1 Blue 的值大 104。
( 9 ) 用 Qiagen 單鏈 DNA 制備試劑盒制備尿嘧啶單鏈 DNA。
3.1.2 尿嘧啶單鏈噬菌體的制備（用于多價噬菌體展示載體， JCFN )
( 1 ) 用 JCFN 質粒轉染 CJ236。熱激之后，與 30 ml 預熱的 2 X YT 和 500 μl 新鮮的 CJ236 ( OD600 值 0.5~1.0 ) 混合，再于 37°C 搖動 6 h。
( 2 ) 完成 3.1.1 節的步驟（4 ) 至（9 )。為測定濃度，混合 3 ml LB 和 0.7% 瓊脂糖（熔化后冷卻至 45°C )，10 μl 連續稀釋的噬粒溶液和 100 μl 新鮮的大腸桿菌。混勻并立即沖入 LB 平板中。在 37°C 培養保育過夜并測定滴度。
3.1.3 突變寡核苷酸的制備
( 1 ) 設計一寡核苷酸，取決于 GC 含量，使其分別含有大約 20 和 15 個堿基的 5' 或 3' 補區。我們使用密碼 NNK 和 NNS 來進行 “硬”隨機化，其中 N 代表所有核苷酸的等摩爾混合；K 代表 G 和 T 的等摩爾混合；S 代表 G 和 C 的等摩爾混合。
( 2 ) 將約 10 μg 溶解于水的粗寡核苷酸做丙烯酰胺凝膠電泳，切出對應于正確分子質量的帶，將寡核苷酸用電洗脫（ 見注 3 )。
( 3 ) 將 2 μg 純化的寡核苷酸、3 μl T4 多聚核苷酸激酶緩沖液、5U T4 多聚核苷酸激酶（New England Biolabs)、1.5 μl 10 mmol/L 腺苷三磷酸混合，加水至 30 μl。37°C 保育 2 h，然后 65°C 保育 15 min。將溶液在一20°C 保存。