3.1.4 雙鏈 DNA 合成
( 1 ) 混合大約 1 μg 尿嘧啶單鏈 DNA、2 μl 磷酸化的寡核苷酸（見 3.1.3)，1 μl 10 X 退火緩沖液（Bio-Rad Metagene kit ) ，加水使體積達 10 μl ( 見注4)。制備一無寡核苷酸的對照反應。
( 2 ) 使用聚合酶鏈反應（PCR) 儀，在 70°C 保溫 5 min，然后以每分鐘降 1°C 的速度，降溫至 30°C。將試管置于冰上。
( 3 ) 在退火混合物中，加入 1 μl 10 X 合成緩沖液（ Bio-Rad Metagene kit ) 、1 μl T4 DNA 連接酶和 1 μl T4 DNA 聚合酶（New England Biolabs)。在冰上和室溫相繼保溫各 5 min，37°C 保溫 30 min，75°C 保溫 15 min，然后冷卻至室溫。將 1 μl 樣品通過瓊脂糖膠 ( 電泳）。含有寡核苷酸的樣品會得到比無核苷酸的對照樣品所得分子質量高的產物。
( 4 ) 把一滴混合物放在飄在水上的 0.025 μm 透析膜碟上，透析合成混合物 1 h，然后在新的微離心管中復原透析過的混合物。使用前保存在冰上。
3.1.5 電穿孔勝任細胞的制備
( 1 ) 在 350 ml 含 Tc 的超級肉湯中培養大腸桿菌 SS-320 直至 OD600 達到 0.8。
( 2 ) 在冰浴中快速冷卻三角瓶中的培養液，然后放置在冰上 15 min。將培養液移至離心瓶，在 0~2°C 以 3900 g [ 4700 r/min，用 JA -10 (Beckman) 或等效轉子 ] 離心 5 min ( 見注 5)。
( 3 ) 撇去上清液，通過在冰上敲擊離心管，將細胞懸浮于 10 ml HEPES 緩沖液中。 加入 390 ml HEPES 緩沖液，并攪動使細胞懸浮。在 0~2°C 以 3900 g 離心 5 min。
( 4 ) 撇去上清液。將細胞懸浮于 10 ml HEPES 緩沖液中并將懸浮物移至 50 ml 離心管。用緩沖液漂洗第一個瓶子并在 50 ml 離心管中恢復細胞懸浮。
( 5 ) 在 0~2°C 以 4300 g ( 6000 r/min，用 SS-34 轉子）離心 10 min。去上清液。在冰上敲擊離心管使細胞懸浮于 10 ml 10% 甘油中，然后加入 20 ml 10% 甘油，并將離心管顛倒數次以使懸浮物混合。
( 6 ) 在 0~2°C 以 4300 g 離心 10 min。去上清液。加 300 μl 10% 甘油，并在冰上敲擊離心管使細胞懸浮。檢查體積，加 10% 甘油使終體積達 700 μl。將懸浮物等分至兩個離心管中（各 350 μl)。
3.1.6 噬粒 DNA 電穿孔轉染
( 1 ) 將冷卻的 DNA [ 見 3.1.4，第（ 4 ) 步 ] 加入放在微離心管中的 350 μl 電轉化感受態細胞中，并在冰上保溫 5 min。將混合物移至預冷的電穿孔試管中（2 mm 間隙)。
( 2 ) 電穿孔細胞，如在 2.5 kV 高壓模式下使用 BTX ECM395 電穿孔器。
( 3 ) 立即在試管中加入 1 ml SOC，并使細胞懸浮。轉移細胞至 250 ml 三角瓶。加 1 ml SOC 到試管中，清洗殘留細胞并移入三角瓶中。再重復此操作 3 次。
( 4 ) 三角瓶中加入 20 ml SOC。在 37°C 以 180 r/min 搖動三角瓶 30 min。并通過放置部分稀釋的懸浮物至 LB- Ap 平板檢查濃度。
( 5 ) 將全部懸浮物加至 500 ml 預熱的 2 X YT-Ap 中。為酵母雙雜交的質粒制備，在 37°C 搖動過夜并制備質粒。為噬粒制備，加入 1010 pfu/ml 輔助噬菌體 KO7，在 37°C 搖動過夜，并如 3.1.1 節所述制備噬粒。
為噬菌體 DNA 的轉化，在第 （3 ) 步之后，加入 1.5 ml 中對數期 SS -320 細胞，然后將懸浮物移至預熱的 120 ml 2 X YT-Tc。按照 3.1.2 節所述測定噬菌體濃度。37°C 保育 4 h。按照 3.1.1 節所述制備噬菌體。
3.1.7 酵母實物庫構建
為酵母雙雜交篩選，在大腸桿菌中，我們按照 3.1 節的描述構建了載體庫，然后將這個庫引入酵母中。酵母轉化系基于 Gietz 的方法 [18] 。用這個方法，我們在典型情況下得到約 106 個獨立克隆。
( 1 ) 在 30°C，20 ml YPD 中搖動過夜生長酵母 EGY48。將培養液加入預熱的 300 ml YPD 使 OD600 值為 0.25。讓細胞生長直至 OD600 值接近 1。
( 2 ) 在室溫下以 3600 g ( 4500 r/min，JA-10 轉子）離心 5 min 。撇去上清液，并懸浮細胞于 300 ml 滅菌水中。重復離心和懸浮。再離心，懸浮細胞于 25 ml 滅菌水，并移至 50 ml 離心管中。室溫以 3000 g ( 5000 r/min，SS34 轉子）5 min。撇去上清液，并懸浮細胞于 1.2 ml 滅菌水。
( 3 ) 將 35 μl 細胞懸浮物放在一邊用作負對照。在余下的細胞懸浮物中加入 7.2 ml 50% PEG3350、1.08 ml 1 mol 乙酸鋰、500 μl 攜帶子單鏈 DNA ( Origene) 、45 μg DNA 和 900 μl 水。徹底混勻，并每份 360 μl 分裝入 30 個微離心管中。在負對照管中加入 1/30 除 DNA 外的上述材料（即 PEG、乙酸鋰和攜帶子 DNA ) ，徹底混勻。
( 4 ) 在 42°C 保育 40 min。在微離心機上以 10000 r/min 轉速室溫離心 10s，撇去上清液。懸浮每管中的細胞于150 μl 水中。將細胞鋪在直徑為 15 cm 的篩選平板上（YC Glc trp - ) 上 。30℃ 保育 3 d。
( 5 ) 每皿加入 15 ml 水，用滅菌的蓋玻片刮散所有菌斑。把所有細胞懸浮在 500 ml 離心管中，并以 3900 g ( 4700 r/min，JA-10 轉子）離心 5 min。撇除上清液，懸浮細胞于 500 ml 水中。再次離心并撇除上清液。懸浮細胞于 50 ml 水中，并測量 OD600 以確定細胞密度（ 1 OD600 對應于約 2X107 個/ml ) 。加入甘油至終濃度 15% ( V/V ) 。分裝并保 存細胞懸浮物于 -80°C。
3.2 噬菌體展示庫分類
3.2.1 掃視（panning)
( 1 ) 加入 50 μl 涂漬溶液到酶聯免疫吸附試驗酶標板（Nunc Maxisorp，可分小孔，C-bottom ) 的小孔中（每孔1 μg 的配體）。把酶標板放入一鋪有濕紙巾的密封盒子中。保持盒子在 4°C 過夜，或 37°C 1 h。
( 2 ) 用移液器除去液體，并用水清洗小孔兩次。加入 360 μl 含 3% BSA 的 TBS 于小孔中。37°C 保育 1 h。為了下一輪實驗，制備一對照小孔；加入無配體的緩沖液，并用 BSA 封閉小孔。
( 3 ) 從小孔移除封閉液，用水清洗兩次。加入 12 μl 5% BSA 溶液和 50 μl 噬菌體懸浮物（1011 個/孔）。室溫保育 2 h。
( 4 ) 移除噬菌體溶液，然后加入 360 μl TBST。用吸管上下有力地吸動。等待 5 min 然后移除溶液（ 第一輪一次，以后每輪 5 次)。
( 5 ) 在小孔中加入 50 μl 含有 10 μmol/L 配體的 TBST 溶液。37°C 保育 1 h，用吸管上下有力地攪動，回收洗脫物。也可以加 50 μl 酸性洗脫緩沖液到小孔中，室溫等待 10 min。用吸管上下有力地攪動。回收第二次洗脫物到裝有 3 μl 2 mol/L Tris-堿的微離心管中，準備中和。
( 6 ) 混合 5 ml 新鮮的 XL- 1 Blue ( OD600 值為 0.5~1；在 LB-Tc 中生長的）和洗脫的噬菌體。對噬菌體，加入 100 ml 2 X YT [ 和異丙基巰基半乳糖苷（ IPTG ) 直至 1 mmol/L 以得到獨體的高產出 ]，并在劇烈搖動的同時，于 37°C 保育 6 h ( 更長的保育時間可能導致獨體基因刪除）。加入 2 X YT 后立即按 3.1.2 節所描述的測定濃度。對噬粒，混合 5 ml 新鮮的 XL-1 Blue 和洗脫的噬粒，37°C 保育 20 min、加入 100 ml 2 X YT ( 以及 IPTG，如果需要）、100 μg/ml AP 以及 1010 個/ml 的輔助噬菌體 KO7；在 37°C 保育 2 h 并保持有力地搖動。Km 至終濃度 70 μg/ml 并保育過夜。保育 20 min 后立即按 3.1.1 節描述測定濃度。按 3.1.1 和 3.1.2 節所述，分 離噬菌體（或噬粒)。重復整個步驟，直至洗脫的噬菌體（或噬粒）數增加。