豬甲狀腺細胞培養實驗_細胞培養技術

豬甲狀腺

F-12培養基胎牛血清胰蛋白酶膠原酶Ⅳ牛 TSH

眼科剪滴管離心機培養皿CO2培養箱

一、實驗步驟

1. 殺豬后迅速取出甲狀腺 1～2 個，置于盛有 75%酒精的燒杯中，用冰盒送至實驗室(1 h 以內)。

2. 立即置于pH為7.4 的PBS緩沖液(含青鏈霉素)中，反復漂洗，直至漂洗液清澈透明。

3. 去除包膜及結締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成1mm³ 大小的碎塊。

4. 置含0.25%胰酶和300 U/ml 膠原酶的容器中，放于 37℃溫箱中消化60 min，每隔15min 需搖動一次。

5. 用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養基終止消化。

6. 以1000  rpm 離心10分鐘后，棄上清。

7. 將細胞沉淀用F-12 培養基制成細胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網(200目)過濾，再以1000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

8. 沉淀懸于含15% 胎牛血清和1 U/L牛 TSH的F-12 培養基中，臺盼藍染色證明活細胞數大于95%，調整細胞濃度接種于培養板中(1 ml/孔)。

9. 置于 37℃的5% CO₂ 孵箱中，每 2-3 天換液一次，至細胞融合成片后用于實驗。

二、結果

豬甲狀腺細胞培養 24 小時，鏡下細胞貼壁，呈聚集生長，細胞呈圓形或橢圓形，如下圖。

    圖 1  培養 24 小時后的豬甲狀腺細胞

1. 原代培養時，接種的細胞活性的好壞直接關系到培養的成敗。

2. 組織熱缺血時間短的組織的細胞活性好。取材后盡量不要耽擱時間，宜盡快處理并培養。

3. 對于僅為單純獨立的甲狀腺腺瘤而質地較軟的組織，因相對容易消化，消化時間可以適當縮短。

4. 鏡下觀察接種到培養瓶中的原代細胞，若大部分為5～10個相連的細胞小團，就最容易生長。

胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織如上皮組織、肝、腎等，對傳代細胞也非常好。

但消化纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。膠原酶對膠原有很強的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。

由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素(TSH)是培養甲狀腺細胞必備的，它能夠起到促進甲狀腺細胞生長的作用。