豬鏈球菌2型檢驗程序

　　一、 分離步驟和程序

　　1.可采集病人的血，腹水，腦脊液或者是尸檢標本;病、死豬的肝臟、脾臟、腹水、心血。4℃保存。

　　2.制作肝臟、脾臟的觸片，或用腹水、血液、腦脊液涂片，火焰固定后進行革蘭氏染色，油鏡下觀是否有成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌。

　　3.取有成對或短鏈狀革蘭氏陽性球菌的標本接種選擇增菌培養液(含15 微克/毫升多粘菌素B，30 微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養基)，或直接劃線接種含兩種抗生素的羊血瓊脂平板培養基，在蠟燭缸或CO2 培養箱中培養。

　　二、 血清學檢測

　　1.用蘭氏分型乳膠凝集鏈球菌試劑盒進行分群

　　2.用豬鏈球菌1-34 個型血清進行分型取一滴豬鏈球菌診斷血清懸滴于載玻片上，與一滴菌懸液充分混合，或用接種環(牙簽也可)刮取單個菌落直接與血清混合，觀察是否出現凝集反應，同時用生理鹽水做對照。

　　三、 生化反應

　　可用API 生化鑒定系統的api-strep 手工鑒定條進行鑒定，該方法可直接鑒定到種。普通實驗室可以重點做VP , 七葉苷水解試驗，6.5%的氯化鈉生長試驗，45 度﹑10 度生長試驗，膽汁耐受(麥康凱培養基)。結果依次為陰性，陽性，陰性，陰性，陰性，陰性，可初步認為豬鏈球菌。可送交到有條件的單位做進一步鑒定。 具有參考價值的生化反應項目有：

　　生長特性

　　10℃ 45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麥康凱培養基(膽汁耐受)

　　不生長 不生長 不生長 不生長 不生長

　　發酵試驗

　　棉子糖 RAF 乳糖LAC 甘露糖MNS 山梨醇SOR 阿拉伯糖ARA 核糖RBS

　　+ + — — — —

　　葡糖INU 甘露醇MAN 丙酮酸 PRV 甘油Glycerol 松三糖melezitose 馬尿酸鹽hippurate

　　+ — — — — —

　　四、 基因鑒定，包括使用PCR 技術和對PCR 產物進行序列分析

　　可挑取分純的菌落或在選擇平板上濕潤的可疑菌落，直接進行PCR 檢測。

　　1、 檢測豬鏈球菌種特異性16S rRNA。

　　上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

　　2、 檢測豬鏈球菌莢膜多糖基因(cps2A)

　　上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

　　3、 檢測溶菌酶釋放相關蛋白編碼基因片段(mrp)

　　上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc

　　下游引物：agtctctaca gctgtagctg g

　　4、PCR反應的條件：

　　94℃預變性5 分鐘;94℃、30 秒，60℃、30 秒，72℃、30 秒，25 個循環，最

　　后延伸72℃、5分鐘。取5 微升擴增產物在1.2℅的瓊脂糖凝膠中進行電泳。

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