琥珀酸脫氫酶及丙二酸的抑制作用實驗

大腸桿菌

琥珀酸鈉  甲烯藍 磷酸 丙二酸溶液 液體石蠟

試管       吸量管   電熱水浴鍋

（一）琥珀酸脫氫酶活力檢查

1. 在1支斜面菌種管中加入約5 ml，0.15 mol/L，pH7.3緩沖液，用玻璃棒刮下斜面上的菌體，振蕩，倒入離心管中，2500 r/ min離心5 min，傾出洗滌液，菌體再加入6 ml，0.15 mol/L，pH7.3磷酸緩沖液，振蕩，制成菌懸液待用。
 
2. 取兩支試管各加入1 ml 0.02 mol/L琥珀酸鈉溶液，1 ml，pH7.3，0.15 mol/L磷酸緩沖液，0.3 ml，0.001  mol/L甲烯藍溶液。在1支試管中加入1 ml菌懸液，另一支試管加入已煮沸5 min的菌懸液1 ml（冷卻后加入）作對照。混勻立即加入0.5～1 ml液體石蠟。
 
3. 將試管于37 ℃水浴恒溫反應，觀察記錄甲烯藍變色所需時間。
 
（二）丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用
 
取3支試管編號，按下表加入試劑：


先在試管中加入琥珀酸鈉、丙二酸鈉、水、磷酸緩沖液、甲烯藍等試劑，混勻后，立即加入一層液體石蠟，于37 ℃恒溫反應，從加入液體石蠟開始記錄甲烯藍變白所需時間。

①第三管加入的菌液預先用沸水煮5 min作為對照管；

②觀察變色時不要振動試管，以免氧氣漏入管內影響變色；

③由于甲烯藍容易被空氣中的氧氧化，所以實驗需在無氧條件下進行。可用液體石蠟封閉反應液。