| 實驗步驟 |
1. 凝膠溴化乙錠染色法
觀察瓊脂糖凝膠中 DNA 的最簡便、最常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色（Sharp
et al. 1973)。溴化乙錠含有一個可以嵌入 DNA 堆積堿基之間的一個三環平面基團。它與 DNA
的結合幾乎沒有堿基序列特異性。在高離子強度的飽和溶液中，大約每 2.5 個堿基插入一個溴化乙錠分子（Waring
1965)。當染料分子插入后，其平面基團與螺旋的軸線垂直并通過范德華力與上下堿基相互作用。這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致與 DNA
結合的染料呈現熒光，其熒光產率比游離溶液中染料的有所增加。DNA 吸收 254 nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身吸收 302
nm 和 366 nm 的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見光譜紅橙區的 590 nm 處重新發射出來（LePecq and
Faoletti 1967)。由于溴化乙錠-DNA 復合物的熒光產率比 沒有結合 DNA 的染料高出 20~30
倍，所以當凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5 μg/ml) 時，可以檢測到少至 10 ng 的 DNA 條帶。
溴化乙錠可以用來檢測單鏈或雙鏈核酸（DNA 或 RNA〉。但是染料對單鏈核酸的親和力相對較小，所以其熒光產率也相對較低。事實上，大多數對單鏈 DNA 或 RNA 染色的熒光是通過染料結合到分子內形成較短的鏈內雙螺旋產生的。
通常用水將溴化乙錠配制成
10 mg/ml 的貯存液，于室溫保存在棕色瓶中或用鋁箔包裹的瓶中。這種染料通常摻入瓊脂糖凝膠和緩沖液的濃度為 0.5
μg/ml。注意：聚丙烯酰胺凝膠灌制時不能摻入溴化乙錠，這是由于溴化乙錠能夠抑制丙烯酰胺聚合。丙烯酰胺電泳通常在電泳結束后用溴化乙錠染色。
盡管在該染料存在的情況下，線狀
DNA 的電泳遷移率約降低 15%, 但是最大的優點是在電泳過程中或在電泳結束后能直接在紫外燈下檢測。當凝膠中沒有 EB 時，凝膠中的 DNA
條帶更為清晰。因此，當需要知道 DNA 片段的準確大小（如 DNA 限制酶酶切圖譜的鑒定），凝膠應該在無 EB 情況下電泳，電泳結束后用 EB
染色。染色時，將凝膠浸入含有 EB（0.5 μg/ml ) 的電泳緩沖液中，室溫下染色 30~45
min。染色完畢后，通常不需要脫色。但是在檢測小量 DNA (<10 ng )片段時，通常要將染色后的凝膠浸入水中或 1 mmol/L
MgSO4 中，室溫脫色 20 min 更易觀察到。
2. 凝膠 SYBR Gold 染色法
SYBR
Gold 是一種新型的極敏感的染料的商品名稱。其與 DNA 結合的親和力高， 并且結合后，能夠極大的增強熒光信號。SYBR Gold-DNA
復合物產生光子的量比 EB-DNA 復合物要大的多，同時其激發的熒光信號強度是 EB-DNA 復合物的 1000 多倍。因此用 SYBR
Gold 染色可以檢測出瓊脂糖凝膠中小于 20 pg 的雙鏈 DNA ( 是 EB 染色最低檢測量的 1/25 ) 。此外，利用 SYBR
Gold 染色可以檢測出一個條帶少至 100 pg 的單鏈 DNA 或 300 pg 的 RNA。SYBR Gold 染料的最大激發波長為
495 nm。同時在 300 nm 有第二個激發峰。其發射的熒光波長為 537 nm。下面是關于 SYBR Gold 詳細的介紹。
DNA 片段經過凝膠電泳分離后，用 SYBR Gold 貯存液的稀釋液（1:10000) 浸染凝膠。不能將 SYBR Gold 加入熔化的凝膠中或電泳前加入凝膠，這是由于在 SYBR Gold 存在的情況下，凝膠中核酸的電泳條帶會產生嚴重變形。
當用
SYBR Gold 染色的凝膠在波長為 300 nm 的紫外照射下具有最高的靈敏度。可以像后面介紹的那樣通過綠色或黃色的濾光片來照像。由于
SYBR Gold 對熒光敏感, 所以其工作液（1:10000 稀釋的貯存液）應該當天用電泳緩沖液新鮮配制，室溫存放。
3. 凝膠中 DNA 的成像
可以用透射或入射紫外光對
EB 染色的凝膠成像。大多數市售的紫外光源發射光的波長為 302 nm。在這一波長下，EB-DNA 復合物的熒光產率遠遠高于在波長 366
nm 處，而略小于在波長 254 nm 處。在波長 302 nm 處，DNA 產生缺口的程度比在 254 nm 處要低的多（Brunk and
Simpson 1977)。
現在可以用完整的成像系統檢測 EB
染色的凝膠。該系統主要包括光源、固定焦距的數碼相機和熱能打印機。在這些系統中的 CCD 相機，采用一種廣角變焦鏡頭（焦距為 75
mm)。這種相機可以檢測出痕量的 EB 染色 DNA ( 聲稱達 0.01~0.5 ng)。在更為
先進的成像系統中，凝膠圖像可以直接輸出到計箅機，直接觀察。圖像在打印之前，可以在計算機的顯示器上進行各種處理，包括視野、焦距和累積曝光時間等方面。每一個圖像都可以被打印和貯存成各種形式的文件，并且可以通過軟件來進一步處理圖像。一
張瓊脂糖圖片的文件大小約為 0.3 M
字節。因此，若要保存大量的圖片，需要一個大貯存量的系統。盡管單個圖片的打印僅需花費幾美分，而通過寶麗來成像需花費約 1
美元，但是一個小的成像系統都需幾千美元，加上其他一系列附件則需花費更多。VENDORS 公司出售的凝膠成像系統，主要包括： AlpHa
Innotech ( San Leandro, California)、 Fotodyne (Hartland, Wisconsin) 和
Stratagene (La Jolla, California)。
盡管可以通過凝膠成像系統獲得的圖片及時進行結果分析，但是打印的圖片在保存的過程中容易褪色，也缺少層次。所以要獲得更為滿意的、保持時間長久的圖片，應采用高靈敏度的寶麗來膠片
57 型或 667 型( ASA 3000)。用高效的紫外光源（>2500 mW/cm2)，一塊 Wratten
22A ( 紅或橘紅）濾光片以及性能良好的鏡頭（f=135 mm)，曝光數秒后就可以獲得少至 10 ng DNA
的條帶圖片。若延長曝光時間并且采用強紫外光源，可以在膠片上記錄到僅 1 ng DNA 所激發的熒光。用常規的濕法處理膠片（如 Kodak
No.4155) 同時采用更小焦距（f=75 mm) 的鏡頭，可以檢測出痕量 DNA
條帶。此時，鏡頭距離凝膠更近，成像集中在膠片的更小的區域。同時，這也可以更為靈活顯影和曬印圖片。
通過采用 SYBR Gold (
Molecular Probe) 對 DNA 染色，可以使成像的靈敏度提高 10~20
倍。當然在通過這種方法提高靈敏度同時，其花費也陡增。10L SYBR Gold 工作液價值超過 100 美元，而同樣量的 EB 的價格約 5
美分。同時檢測 SYBR Gold 染色的 凝膠需要釆用帶黃色或綠色明膠或塞路玢濾片（S-7569, Molecular 或 Kodak)
的相機在波長 300 nm 的紫外透射光下進行。
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