瓊脂糖凝膠電泳實驗

【實驗目的】

學習水平式瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的方法和技術。

【實驗原理】

瓊脂糖凝膠電泳技術是DNA 分子片段的分子量測定和分子構象研究以及DNA 分離純化的重要實驗手段。DNA 分子在瓊脂糖凝膠電泳中泳動時受到電場驅動力和凝膠的摩擦阻力。一般情況下，單位長度雙鏈DNA 帶有幾乎相等的電荷，故在一定電場強度下，DNA 分子的遷移速度取決于凝膠的摩擦阻力，即DNA 分子本身的大小和構型。DNA 分子的遷移速度與相對分子量的對數值成反比關系，具有不同長度的DNA 片段由于其泳動速度不同而得到分離。具有相同一級結構但構型不同的DNA 分子也可以通過這種方法進行分離。

溴化乙錠(EB)是一種熒光染料，在紫外光照射下可發出波長590nm 的紅色熒光，DNA 分子與EB 形成熒光絡合物后，其發射的熒光比原來要增強數十倍，常用來觀察凝膠中DNA 條帶的位置。

【儀器、材料與試劑】

1. 瓊脂糖凝膠(0.7～1.5%，瓊脂糖粉末與1×TAE 配成)，TAE(Tris-乙酸鹽，EDTA)電泳緩沖液[50×濃縮貯存液：Tris 堿242g；冰醋酸57.1mL；0.5 mol/L EDTA (pH8.0)，100mL；加600mL、蒸餾水，劇烈攪拌，加蒸餾水至1000mL，濃鹽酸調pH 至8.0]。

2.溴化乙錠(EB)貯存液(10mg/mL)：在100mLH2O中加入1g溴化乙錠用磁力攪拌器攪拌幾個小時，然后轉至棕色瓶中，4℃貯存(溴化乙錠是強誘變劑，稱量時需要戴手套和口罩，萬一接觸了溴化乙錠，立即用大量的水沖洗)。

3.10×加樣緩沖液：0.25%溴酚藍、0.25%二甲苯青FF、15%的 Ficoll水溶液、0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0、1.0%SDS。

4.刻度量筒、玻璃棒、三角燒瓶、移液槍及槍頭、微波爐或沸水浴、凝膠灌制平板(塑料或玻璃制成)、凝膠樣品梳、穩壓穩流電泳儀、紫外分析儀、數碼相機、封口膠帶和電源等。

【實驗步驟】

1. 用封口膠帶封住塑料托盤開放的兩邊或清潔干燥的玻璃板的邊緣形成一個模具(僅靠用手指沿平板邊緣來回抹幾次，使膠布緊密封住粘縫就可以了)，置一個水平臺上。

2.根據被分離DNA 片段的大小用電泳緩沖液配制適宜濃度瓊脂糖溶液：應準確稱量瓊脂糖干粉將其加入到盛有已定量電泳緩沖液的三角燒瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒攪拌均勻后放入沸水浴或微波爐中加熱至瓊脂糖熔化。

3.瓊脂糖溶液正在冷卻時，用合適的樣品梳形成加樣孔，梳齒的位置應在托盤底面上0.5～1.0mm。

4. 待凝膠稍微冷卻后，將膠緩慢倒入已用膠帶封好的模具中，膠厚度以3～5mm 為宜。

5.讓凝膠溶液完全凝結，室溫下30～45min，待膠略凝結時放入4℃冰箱可大大縮短凝結時間。小心拔出梳子，輕輕撕去封邊膠帶，將凝膠安放到電泳槽內，加樣孔一側靠近陰極(黑末端)。
6.向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒過凝膠約1mm。

7.取適量的DNA 樣品與10×加樣緩沖液混合(分析單一DNA 樣品，如L 噬菌體或質粒DNA，每個5mm寬加樣孔可加100～500ngDNA。如果樣品由不同大小的許多DNA片段組成，如哺乳動物DNA 酶切樣品，則每個加樣孔加入20～30μg 的DNA 也不會造成分辨率明顯下降)，然后用移液槍將樣品加入樣品孔內。一定要包含合適的DNA 分子量標準物，將其分別加至樣品孔的左側和右側孔中。

8.加樣完畢后，關上電泳槽蓋，接好電極插頭。DNA 應向陽極(紅色插頭)側泳動。

給予1～5V/cm 的電壓，其中距離以陽極至陰極之間的測量為準。若電極插頭連接正確，陽極和陰極由于電解作用將產生氣泡。

9.電泳時間的選擇取決于膠的長度、電壓和DNA 片段的大小。膠越長，電壓越低，DNA 片段越大，所需時間就越長。然而使用高壓時，大的DNA 片段的分辨率很低，電泳出的條帶不清晰。

10.當DNA 樣品在凝膠中遷移足夠距離時，關上電源并取出樣品放入事先配好的EB 溶液中染色5～7min(EB 見光分解，應置于暗室中)，在紫外分析儀上觀察并可用數碼相機進行拍攝。

【注意事項】

1. 注意溴化乙錠 (EB)是一種強誘變劑，有致癌嫌疑，操作過程戴手套和口罩，并注意把實驗中沾染EB 和未沾染EB 的實驗器具分開，防止EB 交叉污染！

2. 配膠和灌電泳槽需使用同一批緩沖液。因為pH 或離子強度很小的差別也會在凝膠前部造成紊亂，嚴重影響DNA 片段的泳動。 3.微波爐加熱時間過長，瓊脂糖溶液會變得過熱或劇烈沸騰。應調整好加熱所有瓊脂糖顆粒完全溶解需要的最短時間。

4.溴酚藍與0.5kb 大小的DNA 的泳動度相近，這可給泳動最快的DNA 片段提供一個指示。

5.凝膠要用于印跡分析或將要回收DNA 條帶時，每個樣品必須使用一個新的槍頭。

6.影響DNA 的遷移率的因素：

1)DNA 分子大小：DNA 分子越小，遷移越快。

2)DNA 分子構象：共價閉環DNA>線形DNA>開環雙鏈DNA。

3)瓊脂糖濃度：其濃度越低，遷移越快。

4)兩極間電壓：電壓越高，遷移越快。

7.DNA 區帶不清晰，有可能是點樣量少或過大，但也有可能是電壓過高、凝膠有氣泡、凝膠孔破裂的原因。

8.為了消除 RNA的影響，可以在電泳前加RNA酶(約每10μL DNA加1μL RNA酶)，37℃水浴30min。

9.在進行電泳的過程中，溴酚藍有可能會變黃，這是由于電泳液使用過久或殘留在電泳液中的凝膠變質引起DNA 結構改變或丟失。時常更換電泳液和刷洗電泳槽即可。