瓊脂糖凝膠電泳（agarosegelelectrophoresis）介紹

主要試劑：
核酸電泳緩沖液有三種，即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE與TPE緩沖容量高，DNA分離效果好，但TPE在DNA段回收時含磷酸鹽濃度高，容易使DNA沉淀.TAE緩沖容量低，但價格較便宜，因而推薦選用TBE.緩沖液中的EDTA可螯合二價陽離子，從而抑制DNA酶的活性，防止PCR擴增產物降解。
核酸分離一般用連續緩沖體系，常用的有：
1) TBE：0.08mol/l Tris·HCl，pH8.5，0.08mol/L硼酸，0.0024mol/l EDTA
2) THE：0.04mol/l Tris·HCl。pH7.8，0.2mol/L醋酸鈉，0.0018mol/l EDTA
主要實驗步驟：
1、 用蒸餾水將電泳槽和梳子沖洗干凈.放在水平桌面上，并架好梳子。
2、 取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml,配制成0.5×TBE稀釋緩沖液,待用。
3、 膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖,置于200ml錐形瓶中,加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液,放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為0.8％瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。
4、 膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上,插上樣品梳子,注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持 1mm左右的間隙。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中,而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側,待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內,使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻,速度也不可太快,否則容易出現氣泡。待膠完全凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠,然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起,阻礙緩沖液進入樣品槽中,所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。

瓊脂糖濃度的配置可參照下表：

5、 樣品制備與加樣：溶解于TBE或THE內的樣品應含指示染料（0.025%溴酚藍或桔黃橙）、蔗糖（10%-15%）或甘油（5%％-10%），也可使用 2.5%Fico Ⅱ增加比重，使樣品集中，每齒孔可加樣5-10μg。

6、 電泳：一般電壓為5-15V/cm。對大分子的分離可用電壓5V/cm。電泳過程最好在低溫條件下進行。
7、 樣品回收：電泳結束后在紫外燈下觀察樣品的分離情況，對需要的DNA分子或特殊片段可從電泳后的凝膠中以不同的方法進行回收，如電泳洗脫法：在紫外燈下切取含核酸區帶的凝膠，將其裝入透析袋（內含適量新鮮電泳緩沖液），扎緊透析袋后，平放在水平型電泳槽兩電極之間的淺層緩沖液中，100V電泳2-3小時，然后正負電極交換，反向電泳2分鐘，使透析袋上的DNA釋放出來。吸出含DNA的溶液，進行酚抽提、乙醇沉淀等步驟即可完成樣品的回收。
注意事項：
1、 加熱時, 一定要煮沸, 以保證瓊脂糖的完全溶解。
2、 ?待溶液冷卻至不燙手, 感覺溫暖舒適時加EB. 一定要在通風柜里。
3、 倒膠時, 可用干凈的紙巾拭去氣泡。
4、 膠凝固后先倒入些電泳緩沖液以方便取梳子。
5、 保證緩沖液淹過膠的邊沿, 邊沿部分常高出1-2mm。
6、 有時需要大的上樣孔, 可用膠帶把幾個相鄰的梳齒粘在一起, 這種情況下, 盡量讓膠液冷一些再倒膠。
7、 如果只是為了看一下結果(不需要照相), 同一塊膠可重復用1-3次. 有一次我跑了4遍, 條帶很弱, 用加了EB的緩沖液(約10μ| EB in 50ml 緩沖液)泡半小時后就如正常了。
8、 要保存膠到第二天用, 可以保鮮膜包裹后放入4 度冰箱。
9、 TAE 電泳緩沖液也可重復使用, 至少10次沒有問題。
10、 為了防止電泳時兩極緩沖液槽內pH和離子強度的改變，可在每次電泳后合并兩極槽內 的緩沖液，混勻后再用。