一、電泳前準備
準備內容 | 作用 |
1.刷干凈電泳制膠的梳子，板子，槽子，蒸餾水洗凈晾干 | 防止不必要的重復污染，減少外來的污染。梳子干凈有利于梳孔的形成。 |
2.檢查電泳槽，根據情況更換buffer | 排除電泳槽的電極接觸不良，確保buffer的緩沖能力，減少污染。 |
3.根據DNA的分離范圍選擇合適的膠濃度并記錄 | 達到較好的分離效果，防止樣過快跑出膠或者是過慢浪費時間。 |
4.計算agarose的用量和制膠 buffer的用量記錄，膠最終越薄越好。 | 實驗記錄備查 |
二、制膠
步驟 | 注意事項 |
1.稱量agarose和buffer | Buffer不要用成H2O，稱量相對準確 |
2.融膠，加熱到膠產生大量的氣泡時，拿出搖勻，繼續加熱到完全溶解，拿出搖勻，再加熱到沸騰。 | 非常熱，小心燙手，另外注意不要加熱過度使膠沖出瓶子。因此注意選擇起碼為膠體積2倍以上的瓶子。保證膠混勻和完全溶解，減少可能因此引起的膠中孔徑不均勻影響分離效果。 |
3.倒膠，可用水浴的辦法使膠冷卻到60度左右，即手可以握住瓶子的溫度，沿著制膠板的一側，緩緩地一次性倒入。梳子最好是預先放好并固定的，注意梳孔的體積能點的下所有的樣。用槍頭趕掉氣泡。 | 制膠的桌面相對水平。倒膠時盡量減少氣泡的產生。EB如果在制膠時加入，在60度左右時加入，使終濃度為0.5ug/ml。不宜過低，染色成像不明顯；不宜過高，導致背景太深。搖勻要沿著瓶壁搖動，盡量減少氣泡產生的可能性。高濃度膠例如2%以上的EB很難搖勻，而且凝的速度也相對快，強烈建議跑完膠之后再用EB染色。 |
4.室溫凝膠30分鐘 | 過程中不要碰到梳子，盡量保持膠的位置不移動。時間不宜過久，導致膠干燥變形；不宜過短，影響膠內部孔徑形成。 |
5.拔梳子，放入電泳槽。 | 緩緩地將梳子垂直從梳孔拔出，盡可能使梳子是同時從各個膠孔拔出的。暫時不用的膠最好放入電泳槽電泳液中浸泡。電泳液要浸沒膠1mm。 |
三、上樣電泳
步驟 | 注意事項 |
1.樣品中加入loading buffer使其終濃度為1 X，混勻 | Loading buffer濃度不宜過低，點樣時樣品不能很好的沉在膠孔里；不宜過高，電泳時容易形成帶形的變形。注意混勻。 |
2.點樣 | 沿著膠孔的邊緣勻速加入。盡量避免碰壞膠孔。槍頭不要吸過多的氣泡，拔起時不要過猛帶出樣品。每點一個樣完，吸取buffer洗槍頭，避免樣品混雜。如果是有特殊要求，例如回收，強烈建議每點一個樣換一次槍頭。加樣的速度當然是越快越好，注意保證質量。點樣的量不要太大，一方面是體積不要太大，溢出污染鄰位樣品；一方面兩不要太大，容易導致脫尾和模糊不清。 |
3.接通電源，選擇合適的電壓和時間電泳。 | 膠孔與電極成水平狀態，防止樣品跑歪。跑膠期間不時回來看看，防止樣品跑出膠等意外發生。 |
四、染色成像
步驟 | 注意事項 |
1.染色 | 如果膠中沒有加入EB，用0.5ug/ml的EB溶液浸染30分鐘。 |
2.調整鏡頭的拍攝范圍和焦距，成像 | |
3.打印照片做分析記錄 |