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  • 發布時間:2020-09-07 20:14 原文鏈接: 生化分離技術——柱層析(columchromatography)分離(2)

    由于某些原因,用到的淋洗劑多是大包裝的(便宜嘛),我們這里是用10升或25升的塑料桶裝的,就要注意這些工業品的純度是較低的。經常能夠從送來的大桶底部看見有色的雜質,其他的雜質就可想而知了,所以在比較嚴格的柱分時就要對溶劑重蒸。當然過原料時就可以免去這一步了,反正下面還有提純的方法。

    另外溶劑在過柱子后最好也回收使用,一方面環保,另一方面也能節省部分經費,缺點是要消耗一定的人工。這里要注意的是,一般在過柱同時進行的是減壓旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例由于揮發度的不同會導致極性的變化,一般會使得極性變大,在梯度淋洗時比較合適,正好極性越來越大了。在過完柱子后,溶劑最后回收要采用常壓,因為在減壓旋蒸時會有部分低沸點的雜質一起出來,常壓時就會減少這種現象,如果雜質和你下面要過的樣品有反應那就慘了。

    關于操作問題

    1 裝柱

    柱子下面的活塞一定不要涂潤滑劑,會被淋洗劑帶到產品中的,可以采用四氟節門的。干法和濕法裝柱覺得沒什么區別,只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該要適度的緊密(太密了淋洗劑走的太慢),一定要均勻(不然樣品就會從一側斜著下來)。書中寫的都是不能見到氣泡,我覺得在大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響,一加壓氣泡就全下來了。當然如果你裝的柱子總是有氣泡就說明需要多練習了。但是柱子更忌諱的是開裂,甭管豎的還是橫的,都會影響分離效果,甚至作廢!

    2 加樣

    用少量的溶劑溶樣品加樣,加完后將下面的活塞打開,待溶劑層下降至石英砂面時,再加少量的低極性溶劑,然后再打開活塞,如此兩三次,一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗劑,一開始不要加壓,等溶樣品的溶劑和樣品層有一段距離(2~4cm就夠了),再加壓,這樣避免了溶劑(如二氯甲烷等)夾帶樣品快速下行。

    3 淋洗劑的選擇

    感覺上要使所需點在rf0.2~0.3左右的比較好。不要認為在板上爬高了分的比較開,過柱子就用那種極性,如果rf在0.6,即使相差0.2也不容易在柱子上分開,因為柱子是一個多次爬板的狀態,可以通過公式的比較:0.6/0.8一次的分離度,肯定不如(0.2/0.3 )的三次方或四次方大。

    4 樣品的收集

    用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。所以如果樣品與硅膠的吸附比較強的話,就不容易流出。這樣就會發生,后面的點先出,而前面的點后出。這時可以采用氧化鋁作固定相。

    另外,收集的試管大小要以樣品量而定,特別是小量樣品,如果用大試管,可能一根就收到了三個樣品,wuwu。如果都用小試管那工作量又太大。

    5 最后的處理

    柱分后的產品,由于使用了大量的溶劑,其中的雜質也會累積到產品中,所以如果想送分析,最好用少量的溶劑洗滌一下,因為大部分的雜質是溶在溶劑里的,一洗基本就沒了,必要時進行重結晶。

    另外,再過柱的時候,有時會出現氣泡,一是和使用的溶劑有關,如果是易揮發的溶劑,如乙醚、二氯甲烷等,在室溫稍高的情況下,很容易出現這種現象,因此,在室溫高的時候,可以選擇沸點較高,揮發相對小的溶劑。還有,使用混合溶劑時,使用的兩種溶劑的沸點應該相差不大,如:乙酸乙酯和石油醚 (60~90),而乙醚卻要選擇30-60的石油醚。二是:不論是用帶砂板的還是塞棉花的,在裝柱之前,都要將空氣用加壓的方法將空氣排干,這樣就可避免柱中有空氣!過柱子需要耐心,不要著急.

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