生化實驗講義(理論部分)——電泳技術（二）

4.9 梯度凝膠電泳

梯度凝膠電泳也通常采用聚丙烯酰胺凝膠，但不是在單一濃度（孔徑）的凝膠上進行，而是形成梯度凝膠。從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為5％，底部凝膠濃度為25％。凝膠梯度是通過梯度混合器形成的，高濃度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液濃度呈梯度下降，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小。梯度凝膠電泳也通常加入SDS，并有濃縮膠。電泳過程與SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳基本類似。與單一濃度的凝膠相比，梯度凝膠有幾個優點：①首先，梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時分離較大范圍分子量的蛋白質。單一凝膠電泳對于分子量超過其分離范圍的蛋白質，過大或過小，都不能分離。而梯度凝膠孔徑范圍比單一凝膠大，分子量較大的蛋白質可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質可以同時得到分離。例如用4％～30％的梯度膠可以分離分子量5萬～200萬的蛋白質。② 另一個優點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質。電泳過程中，蛋白質在梯度凝膠中遷移，經過的孔徑越來越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣電泳過程中蛋白質就被濃縮，集中在一個很窄的區帶中。而分子量略小的蛋白質可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變小，在蛋白質不能通透的孔徑附近對蛋白有濃縮作用，所以電泳后形成很窄的區帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質。對于太稀的樣品，在電泳過程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質分子最終都會滯留在其相應的凝膠孔徑中而得到分離。③ 可以直接測定天然狀態蛋白質的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測定分子量的方法互為補充。

梯度凝膠電泳主要適用于測定球蛋白的分子量，而對纖維蛋白將產生較大的誤差。由于分子量的測定必須是在未知和標準蛋白質分子到達完全被阻止遷移的孔徑時才能成立，因此電泳時要使用較高的電壓，例如平板凝膠為0.5mm厚，使用600V電壓， 50mA電流，電泳時間約需2小時。

4.10 等電聚焦

等電聚焦電泳是根據兩性物質等電點（pI）的不同而進行分離的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等電點相差0.01的蛋白質，是分離兩性物質如蛋白質的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過加入兩性電解質形成一個pH梯度，兩性物質在電泳過程中會被集中在與其等電點相等的pH區域內，從而得到分離。

兩性電解質是人工合成的一種復雜的多氨基－多羧基的混合物。不同的兩性電解質有不同的pH梯度范圍，既有較寬的范圍如pH＝3～10，也有各種較窄的范圍如pH＝7～8。要根據待分離樣品的情況選擇適當的兩性電解質，使待分離樣品中各個組分都在兩性電解質的pH范圍內，兩性電解質的pH范圍越小，分辨率越高。

等電聚焦多采用水平平板電泳，也使用管式電泳。由于兩性電解質的價格昂貴，使用1～2 mm厚的凝膠進行等電聚焦價格較高。使用兩條很薄的膠帶做為玻璃板間隔，可以形成厚度僅0.15 mm的薄層凝膠，大大降低成本，所以等電聚焦通常使用這種薄層凝膠。由于等電聚焦過程需要蛋白質根據其電荷性質在電場中自由遷移，通常使用較低濃度的聚丙烯酰胺凝膠（如4％）以防止分子篩作用，也經常使用瓊脂糖，尤其是對于分子量很大的蛋白質。制作等電聚焦薄層凝膠時，首先將兩性電解質、核黃素與丙烯酰胺貯液混合，加入到帶有間隔膠條的玻璃板上，而后在上面加上另一塊玻璃板，形成平板薄層凝膠。經過光照聚合后，將一塊玻璃板橇開移去，將一小薄片濕濾紙分別置于凝膠兩側，連接凝膠和電極液（陽極為酸性如磷酸溶液，陰極為堿性如氫氧化鈉溶液）。接通電源，兩性電解質中不同的等電點的物質通過電泳在凝膠中形成pH梯度，從陽極側到陰極側pH值由低到高呈線性梯度分布。而后關閉電源，上樣時取一小塊濾紙吸附樣品后放置在凝膠上，通電30 min后樣品通過電泳離開濾紙加入凝膠中，這時可以去掉濾紙。最初樣品中蛋白質所帶的電荷取決于放置樣品處凝膠的pH值，等電點在pH值以上的蛋白質帶正電，在電場的作用下向陰極移動，在遷移過程中，蛋白質所處的凝膠的pH值逐漸升高，蛋白質所帶的正電逐漸減少，到達pH＝pI處的凝膠區域時蛋白質不帶電荷，停止遷移。同樣，等電點在上樣處凝膠pH以下的蛋白質帶負電，向陽極移動，最終到達pH＝pI處的凝膠區域停止。可見等電聚焦過程無論樣品加在凝膠上什么位置，各種蛋白質都能向著其等電點處移動，并最終到達其等電點處，對最后的電泳結果沒有影響。所以有時樣品可以在制膠前直接加入到凝膠溶液中。使用較高的電壓（如2000V，0.5mm平板凝膠）可以得到較快速的分離（0.5～1小時），但應注意對凝膠的冷卻以及使用恒定功率的電源。凝膠結束后對蛋白質進行染色時應注意，由于兩性電解質也會被染色，使整個凝膠都被染色。所以等電聚焦的凝膠不能直接染色，要首先經過10％的三氯乙酸的浸泡以除去兩性電解質后才能進行染色。

等電聚焦還可以用于測定某個未知蛋白質的等電點，將一系列已知等電點的標準蛋白（通常pI在3.5～10之間）及待測蛋白同時進行等電聚焦。測定各個標準蛋白電泳區帶到凝膠某一側邊緣的距離對各自的pI值作圖，即得到標準曲線。而后測定待測蛋白的距離，通過標準曲線即可求出其等電點。