生殖道衣原體感染的診斷需要依靠性接觸史、臨床表現和化驗檢查結果。當有典型的尿道炎、宮頸炎癥狀時，診斷不難。但由于無癥狀感染多見，化驗檢查顯得十分重要。
通過化驗可以確定病因，從而針對病因進行治療，并有助于對病人的性伴作治療以防止進一步傳播;還可發現無癥狀感染者，有助于消除傳染源;在女病人中檢查并治療衣原體感染將能防止異位妊娠或不育的發生。
診斷沙眼衣原體感染的化驗檢查方法包括標本涂片染色檢查、衣原體培養法、衣原體抗原檢測、DNA檢測及PCR檢測。涂片檢查是一種簡便、價廉的診斷方法，可用于新生兒眼結膜刮片的檢查，但它不適宜用于生殖道沙眼衣原體感染的診斷，因為在這種情況下，它的敏感性和特異性均極低。
衣原體培養是目前檢測沙眼衣原體感染最為敏感和特異的方法，敏感性為70%～95%，可用作確證試驗和治療后的判愈試驗，但條件要求高，價格昂貴。抗原檢測法診斷沙眼衣原體感染的敏感性為70%～90%，特異性為83%～99%，快速，價廉，操作簡便，但對于實驗人員的技術水平要求較高。PCR診斷生殖道沙眼衣原體感染的敏感性高于培養法，特異性可達99%～100%，但檢測條件和操作人員的水平要求高，容易導致出現假陽性結果，僅適合在高級別醫院或機構開展。
此外，在性病性淋巴肉芽腫和沙眼衣原體性附睪炎、輸卵管炎時，檢測血清抗體水平有助于診斷。值得注意的是，目前在各種形形色色的性病診所或機構中盛行的多媒體顯微儀(MDI)檢查，其可靠性沒有得到科學的證明，其應用也未得到國家衛生機構的批準。