近年來隨著分離純化技術的提高,關于外泌小體的研究成果頗豐;這進一步吸引了越來越多領域的課題將外泌體納入研究對象。研究的前提是方便、高效、標準化地分離純化外泌小體。經過近20年的探索,已經建立了超速離心法、沉淀法、色譜法、親和純化法等。
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經典超速離心法制備外泌體
超速離心法是制備外泌體的金標方法,
但是有所局限:
設備非常昂貴
對經驗要求較高
操作時間長,有一定的安全風險
100,000×g離心,操作時長超過5個半小時
在大量實踐中大家逐漸認識到根據下游研究對樣品的要求,以及起始樣品的規模、數量,可以選擇不同的外泌體制備策略。因不需要特殊的設備和試劑盒,對操作人員也沒有特別的經驗要求,超濾法后來居上,成為實驗室中制備外泌體的通用方法。
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過濾+超濾
簡單兩步,快捷制備外泌體

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根據起始樣品量選擇合適規格的過濾和超濾工具

制備的外泌體用于細胞學或動物實驗前需要做無菌處理
Ultrafree離心式微濾管
TIPS
無血清樣品選擇3KD孔徑為了盡可能提高外泌體的回收率。
有血清樣品選擇100KD/500KD孔徑為了盡可能去除細胞分泌蛋白以及血清成分中的白蛋白影響。
樣品體積大于30mL時可以考慮用超濾杯或Centricon 70,注意超濾杯在200mL以內時吸附損耗可能較超濾管有所增加。
不同方法制備外泌小體產量比較
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默克生命科學超濾法制備的外泌小體電鏡照片(放大倍數87000×)。小體直徑16 - 82nm,有些達到485nm。
進一步精制……
經過簡便的“微濾澄清+超濾富集”兩步法,制備的外泌體可直接用于下游各種分析,如果需要純度更高的外泌體,可以采用抗體包被的瓊脂糖珠或磁珠進一步純化。
抗體包被磁珠親和純化