生物反應器在病毒載體生產中的應用

摘要

scale-X 生物反應器是一種新型固定床系統，可用于貼壁和懸浮細胞系的培養。設備單元占地小，而具有相當大的表面積，從而可獲得極高細胞密度。本研究比較了在scale-X hydro生物反應器和標準微載體培養體系中進行的貼壁Vero細胞培養。兩種系統可獲得相似的單位面積細胞濃度。隨后，展開螺旋卷式固定床顯示，細胞在軸向和徑向上具有均勻的分布。這表明在生物反應器內部具有均勻的液體流動和細胞附著。觀察到的均質的細胞生長是一個重要的規模放大因素，以按可重復的方式，實現可用表面積最大限度的利用。

scale-X生物反應器簡介

大多數病毒疫苗的生產工藝基于貼壁細胞平臺。典型的培養系統，如滾瓶、多層細胞培養皿和微載體生物反應器，在規模放大時，都有一定的限制。為了克服潛在的規模放大限制，簡化生產，固定床生物反應器是一個極具價值的替代選擇。創新的scale-X生物反應器是一種可規模放大的固定床系統，可從研發（2.4 m²生長表面積）放大到中試（10和30m²生長表面積）和生產規模（200和600m²生長表面積；圖1）。scale-XZL技術使用了一種結構化的螺旋卷式非編織聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET）固定床，以減少局部過度壓實和死區，同時實現可用內表面積及質量的最佳利用，獲得批次間的高可重復性（圖2）。

材料、方法 & 設備
固定床工藝：scale-X hydro生物反應器

細胞系和工藝條件
 

用于細胞密度和分布評估的方法
?  可從固定床提取12根整合的取樣條（每根1面積2.15 cm²）在1 mL細胞裂解緩沖液中充分混合3 min。消化的細胞核用結晶紫染色并進行計算。
?  當達到目標細胞密度后，取出固定床，小心地鋪開，剪下確定的1 cm²面積（圖3）。條帶上的細胞用試劑A100（ChemoMetec）裂解，并使用血細胞計數器對細胞核進行計數。

圖1. scale-X生物反應器規格，從hydro（2.4 m²，用于R&D）到carbo（10和30 m²，用于臨床期）以及nitro（200和600 m²，用于大型生產）
 

圖2. scale-X生物反應器系列中的ZL固定床結構及培養基流道
 

圖3. scale-x固定床中用于細胞密度檢測的取樣點

對照工藝：在攪拌罐生物反應器（STR）中進行Cytodex? 1微載體培養

細胞系和工藝條件
 

用于細胞密度和分布評估的方法
?  從生物反應器取5 mL樣品體積。進行三次的洗脫后，用0.1 M檸檬酸、0.1%結晶紫和0.1% Triton X-100溶液裂解細胞。
?  37℃孵育1小時后，用血細胞計數器對染色的細胞核進行計數。該方法詳細描述，參見Trabelsi et al.文章（Khaled Trabelsi, 2004）。

工藝參數（用于兩種培養）
?  添加4 mM谷氨酰胺的無血清培養基（VP-SFM， Gibco?）
?  補加葡萄糖和谷氨酰胺原液，以分別防止兩種底物低于8 mM和2 mM
?  使用CO₂和 0.5 NaHCO₃（微載體）或0.5 NaOH（scale-X）將pH值控制為7.2
?  溫度設定點為37℃
?  溶氧設定點為50%（頂部空間通氣）

VERO細胞生長
比較不同生物反應器系統內的最大Vero細胞密度（Kiesslich，2020）（圖4）：

scale-X hydro 生物反應器（2.4 m²）:2.7 x 10⁵ cells/cm²
STR Cytodex? 1（0.75 m²）：2.4 x 10⁵ cells/cm²

不同的細胞接種密度導致了不同但相當的生長曲線圖。scale-X生物反應器中的單位面積細胞密度（2.7x 10⁵ cells/m²）略高于微載體培養（2.4 x 10⁵ cells/m²）。兩種系統的培養基使用量接近，為2.1 - 2.2 ×10⁹ cells/L_培養基。當考慮兩個系統在同等產量下的反應器體積時，固定床生物反應器的設備占地顯著降低（降低5倍）。

圖4. 相比標準微載體培養，scale-X hydro生物反應器中的Vero細胞生長，由Kiesslich et al.（2020）提供。

Univercells進行了延長的Vero細胞生長研究（圖5）。在scale-X hydro生物反應器中進行了多次實驗（n=26），獲得了可重復的細胞密度，平均為2.5×10⁵ cells/cm²。規模放大至更大的scale-X carbo生物反應器（10m²和30m²），可獲得相似的單位面積細胞密度。

圖5. Vero 細胞曲線圖：試驗以Vero 細胞生長在不同scale-x 規格體積（內部數據）

在結構化、螺旋卷式固定床中的Vero細胞分布

在培養的不同階段（2.7×10⁵ cells/cm²和5.3×10⁵ cells/cm²時，圖6），對Vero細胞分布進行了研究。為此，從展開的固定床中提取了9個樣本，并測定細胞密度。

在scale-X hydro生物反應器中，Vero細胞在固定床中軸向和徑向均勻分布。研究進行了進一步的計算機流體動力學研究，結果顯示，在結構化固定床中沒有死區和非均勻性（數據未顯示）。均勻的細胞生長使可用表面積得到充分利用。

圖6. scale-X生物反應器的結構化固定床中的Vero細胞生長分布。

細胞沿徑向（從中心半徑）和軸向（固定床高度）均勻分布。（a.）由Kiesslich et al.（2020）友情提供，（b.）在Univercells實驗室進行。

總結

在這兩種工藝中，貼壁Vero細胞達到了相同的密度。當轉移到更大的固定床scale-X生物反應器時，達到了類似的細胞生長趨勢和最高單位面積細胞密度。最后，對Vero細胞生長分布的研究顯示，固定床內有均勻的細胞貼壁和生長。與微載體工藝相比，固定床的緊湊設計使設備占地面積降低5倍。

總體而言，結果表明，結構化的scale-X固定床生物反應器系統是傳統“規模擴展”技術的合適替代方案，后者如多層培養皿和滾甁，也包括具有一定技術挑戰性的培養系統，如微載體工藝。

目前的scale- X生物反應器可以轉化至生產規模（600 m²），并整合到連續的NevoLine?生產平臺中。NevoLine系統將強化的上游工藝與連續的下游工藝相結合，以降低資本投入和運營成本，實現低成本、大規模的生產能力。

參考文獻

Khaled Trabelsi, S. R. (2004). Comparison ofvarious culture modes for the production of rabies virus by Vero cells grown onmicrocarriers in a 2-l bioreactor. Enzyme and Microbial Technology.

Kiesslich, S.V.-C.-F. (2020). Serum-free production of rVSV-ZEBOV in Vero cells:Microcarrier bioreactor versus scale-X? hydro fixed-bed. Journal of Biotechnology.