生物大分子X射線小角散射實驗指南

    導讀：基于同步輻射的X射線小角散射實驗可以實現高通量以及更高的分辨率和信噪比。本文簡單介紹了生物大分子小角散射（BioSAXS）的數據收集策略以及樣品準備要求，看完這篇就可以準備樣品直接去BL19U2收集小角數據了！

BioSAXS的目標

    生物分子的小角X射線散射（以下簡稱生物小角，Bio-SAXS）是以生物分子作為研究對象的小角X射線散射技術。生物大分子（蛋白質和核酸）的尺度正好處于納米尺度，是小角散射研究的重要領域之一。

    我們通過ATSAS程序組給出的一張圖來看BioSAXS能夠給出什么信息，解決什么問題。首先，散射信號可以給出分子的全局信息，比如大小尺寸（Rg，Dmax）、分子量；也可以通過Kratky圖得到蛋白折疊程度的信息。隨著計算技術的發展，可以通過第一性原理建模，利用虛擬原子搭建分子的三維模型，由于分辨率較低，大家一般稱之為輪廓。對于復合物，當有各個部分的晶體結構存在，可以通過剛體建模構建復合物模型。還可以擬合出蛋白中缺失的loop區域。分析溶液中的蛋白的聚合狀態，即不同寡聚體的比例。最后，對于具有內部柔性的蛋白（這類蛋白往往難以結晶），也可以通過系綜篩選的方法得到一個溶液中的最優構象分布。

溶液散射的特點

    生物大分子在溶液中，不像在晶體中是按照點陣排列的，因此散射信號在所有可能的空間取向上平均，最終得到的散射信號為一維曲線。晶體衍射中有幾千乃至上萬個點的強度信息，仍然會面臨相位信息缺失的問題，小角散射信號可能只有幾百個點的數據，對于分子結構而言，采樣率遠遠不夠。

    另一個方面，生物分子，特別是蛋白質與溶劑的電子密度差小，而SAXS測量的是電子密度的漲落，因此散射信號弱。不僅如此，散射信號來自溶液中所有分子的散射，當有多種組分存在，且結構都未知的話，幾乎不可能得到有效的結構信息。下圖中所示的粒子懸浮在溶劑中，粒子的散射信號需要扣減溶劑背景，如果所扣背景和溶劑成分存在差別，也會引起粒子散射信號的偏差。

    最后，高強度的X光會在溶液中引起樣品的輻射損傷。入射X射線與樣品中的水分子的相互作用產生羥基或過氧自由基，自由基活化的蛋白傾向于通過共價和/或非共價鍵交聯，從而誘導聚集。BioSAXS的樣品是溶液，這也意味著它們不能像晶體那樣被冷凍。解釋受輻射效應影響的散射數據幾乎是不可能的，因此必須盡量減少這些影響。

BioSAXS數據收集策略

    SAS實驗的基本目的是測量由于分離的大分子形成的散射。它們總是溶解在水溶液中，因此有必要從樣品的測量散射曲線中減去溶劑或其它外來源的任何貢獻。

    實驗站的設置主要有以下四點（我們已經小心地做好了）：
    首先，探測器會帶來電子噪聲或暗電流，通過選用光子計數探測器并維持在一個合適的環境中（干燥加冷卻，設置合適的能量預知）可以使得該項非常弱乃至可以忽略。

    第二，光路中的雜散射，選用無散射狹縫并細致地調節狹縫組可以有效地降低光路中的寄生散射，減少空氣段并維持較低的真空度也能有效降低背底。

    第三，樣品池的選擇，X射線散射通常使用玻璃毛細管或使用云母作為窗口的樣品池，需要小心地避開容器中的劃痕。

    第四，記錄透射光強。不同的樣品有不同的吸收值，從而影響被散射的光子數目。在top-up模式下，采用透射光強的比值來確定樣品的入射光強。

    然后，就是上樣，打開光閘，收集數據（是不是還有點小激動）。同樣需要注意四點：

    第一，樣品前后各收集一次緩沖液的數據，在保證溶液和溶劑的緩沖液組成完全匹配的情況下，這樣做的好處是避免背景散射隨時間的漂移。

    第二，每個樣品采用多次（例如，十或二十）曝光模式進行收集，記錄的圖案被單獨處理并且彼此進行比較，顯示出系統變化（主要是輻射損傷）的圖案則不包括在隨后的平均和進一步的數據處理中。

    第三，對同一個樣品收集多個濃度。推薦使用的樣品濃度范圍1-10 mg/ml ，對同一個蛋白樣品至少測量三個濃度(如1、3、5……)。

    第四，在同步輻射裝置進行試驗時，緩沖液中應該添加自由基清除劑以降低輻射損傷。常用試劑為 DTT (2-10 mM，推薦使用 2mM)，TCEP (1-2mM)，或 glycerol (~5%)。如果使用 DTT，記得防止其被空氣氧化，可以在數據收集之前添加。

樣品準備

    樣品其實是第一重要的。雖然任何樣品都會給出散射信號，只有均一性好的樣品才能給出可以分析的數據！

    首先，選擇合適的緩沖液成分可以幫助最小化樣品聚合和降低輻射損傷 ：a、鹽濃度少于 500 mM；b、推薦使用 HEPES 或 TRIS 組分的緩沖液，在沒有使用自由基清除劑的情況下， HEPES 或 TRIS 也可以成為自由基清除劑。

    其次，確保緩沖液與蛋白溶液匹配：a、最好取蛋白透析過程的透析液作為對照緩沖液，推薦長時間(16-48 小時)透析的透析液。 b、若受樣品穩定性或準備時間的限制，不方便進行透析操作。可選用合適分子量的濃縮管對緩沖液進行高速離心。c、緩沖液最好進行真空/超聲脫氣以避免數據收集時形成氣泡。d、樣品透析之前，先用 0.22um 的膜進行過濾。

    再次，確認樣品純度以及聚合狀態： 可以使用的方法包括 SDS PAGE，本體凝膠過濾(native gel filter)，動態光散射(DLS)，分析超速離心及 FPLC。確保測量系統為一個單分散體系。

    最后，確定樣品濃度：對大部分蛋白樣品使用 OD280，DNA 使用 OD260。