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  • 發布時間:2021-05-24 14:59 原文鏈接: 生物技術常用實驗操作簡介

       一、總RNA的提取(Trizol法提取)

      在收集到生物材料之后,最好能即刻進行RNA制備工作。若需暫時儲存,則應以液氮將生物材料急速冷凍后,儲存于-80℃冷凍柜。在制備RNA時,將儲存于冷凍柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破細胞,不可以先行解凍,以避免RNase的作用。

      1.  提取組織RNA時,每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對組織進行裂解;提取細胞RNA時,先離心沉淀細胞,每5-10 ╳106個細胞加1ml Trizol后,反復用槍吹打或劇烈振蕩以裂解細胞;

      2.  將上述組織或細胞的Trizol裂解液轉入EP管中,在室溫15~30C下放置5分鐘;

      3.  在上述EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿,蓋上EP管蓋子,在手中用力震蕩15秒,在室溫下(15℃~30℃)放置2~3分鐘后,12000g(2℃~8℃)離心15分鐘;

      4.  取上層水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇,在室溫下(15℃~30℃)放置10分鐘,12000g(2℃~8℃)離心10分鐘;

      5.  棄上清,按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇進行洗滌,渦旋混合,7500g(2℃~8℃)離心5分鐘,棄上清;

      6.  讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥;

      7.  用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。

      二、瓊脂糖核酸電泳

      1.  用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈,放在制膠平板上,封閉模具邊緣,架好梳子;

      2.  根據欲分離DNA 片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠:準確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶內,定量加入電泳緩沖液(一般20~30 ml);

      3.  放入到微波爐內加熱熔化。冷卻片刻,加入一滴熒光染料,輕輕旋轉以充分混勻凝膠溶液,倒入電泳槽中,待其凝固;

      4.  室溫下30~45分鐘后凝膠完全凝結,小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內;

      5.  向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內有氣泡,應設法除去;

      6.  在DNA樣品中加入10×體積的載樣緩沖液(loading buffer),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內;

      7.  接通電源,紅色為正極,黑色為負極,切記DNA樣品由負極往正極泳動 (靠近加樣孔的一端為負)。一般60~100V電壓,電泳20~40min即可;

      8.  根據指示劑泳動的位置,判斷是否終止電泳;

      9.  電泳完畢,關上電源,在凝膠成像儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標準Marker比較被擴增產物的大小。

      瓊脂糖凝膠濃度  線形DNA的最佳分辨范圍(bp)

      0.5%   1,000~30,000

      0.7%   800~12,000

      1.0%   500~10,000

      1.2%   400~7,000

      1.5%   200~3,000

      2.0%   50~2,000

      三、膠回收純化DNA

      1.  瓊脂糖電泳,將特異電泳帶用刀切下放入到EP管中,稱瓊脂糖帶的重量;

      2.  按照每100mg加400μl的量加入binding buffer,放入到EP管振蕩器中,45℃~55℃溫育振蕩,直到所有的瓊脂糖都溶解(大概要5分鐘);

      3.  取出純化柱,將上述溶解液轉移至柱中,室溫下放置2分鐘,8,000rpm 離心1分鐘,棄EP管中的液體,將純化柱放回EP管中;

      4.  加500μl的wash buffer至柱中,8,000rpm 離心1分鐘。棄管中的溶液;

      5.  重復操作4步的操作1次,最后將純化柱放入EP管中10,000rpm離心30秒,除去痕量的wash buffer;

      6.  將純化柱放入一個新的EP管。加30~40μl H2O或者elution buffer至純化柱膜的中央,在37℃或50℃下放置2分鐘,10,000rpm離心1分鐘洗脫DNA,將EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。

      7.  注:若想要不電泳而直接純化DNA溶液,只需要在第2步中按100μl液量加400μl的binding buffer,其余的步驟不變。

      四、大腸桿菌質粒DNA的提取(堿裂解法)

      此方法適用于小量質粒DNA的提取提取的質粒DNA可直接用于酶切PCR擴增。

      1.  取1.5ml細菌培養物于EP管中,4000rpm離心1分鐘,棄上清液,使細菌沉淀盡量干燥;

      2.  將細菌沉淀重懸于用冰預冷的100 μl溶液I (50 mmol/L葡萄糖,10 mmol/L EDTA pH 8.0,25 mmol/L Tris-HCl pH 8.0) 中,劇烈振蕩;

      3.  加入200 μl新配制的溶液II(0.2 mol/L NaOH,1%SDS(m/v)),蓋緊EP管口,快速顛倒離心管5次,以混合混合物,確保離心管的整個內表面與溶液II接觸,不要渦旋,置于冰浴中。


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