(1)加熱法
當待測組分熱穩定性好時,可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白質沉淀。加熱溫度視待測組分的熱穩定性而定,通常可加熱到90℃。蛋白質沉淀后可用離心或過濾除去,這種方法最簡單,但只能除去熱變性蛋白質。
(2)鹽析法
利用不同蛋白質在高濃度的鹽溶液中溶解度不同程度的降低來沉淀除去蛋白質。在低鹽濃度下,蛋白質溶解度隨著鹽濃度的升高而增加,稱為鹽溶作用。當鹽濃度不斷升高時,不同蛋白質的溶解度又以不同程度下降,并先后析出沉淀,稱為鹽析作用。這是由蛋白質分子內及分子間電荷的極性基團的靜電引力造成的。由于水中加入了少量的鹽,增加了溶液的極性,減弱了蛋白質分子間的作用力,促使其溶解度增大。當鹽濃度增加到一定程度時,水活度被降低,蛋白質表面的電荷大量被中和,水化膜被破壞,白質分子又相互聚集沉淀析出鹽析法的優點是對設備和條件要求低,安全,應用范圍廣泛,一般可在室溫下操作常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力強,飽和液濃度大,溶解度受溫度影響小,一般不會使蛋白質變性。缺點是緩沖能力差,pH值常在4.5～5.5。
鹽析時要注意以下幾個問題。
①鹽的飽和度影響 鹽的飽和度是影響蛋白質鹽析的重要因素,不同的蛋白質鹽析所要求的飽和度不同。
②pH值的選擇 蛋白質在等電點(pI)時的溶解度最小,最易從溶液中沉淀析出,因此進行鹽析時的pH值要選擇在被沉淀蛋白質的pI附近。
③蛋白質濃度的影響 在相同鹽析條件下蛋白質濃度越大,越易沉淀。
④溫度的影響 一般可在室溫下進行。
(3)等電點沉淀法
利用蛋白質在等電點時溶解度最低,用酸、堿調節pH值,可使蛋白質沉淀析出,但這時沉淀不完全,可與有機溶劑沉淀法、鹽析法聯合使用。
(4)膜分離法
膜分離技術包括超濾、反滲析、電滲析、微孔過濾等。利用膜分離技術可將樣品小分子化合物和大分子的蛋白質很好地分離。
超濾是一種除去樣品中蛋白質和其他大分子的方法,是能用分子分離的薄膜分離技術,依靠薄膜兩側壓力差作為推動力來分離溶液中不同分子量的物質。與沉淀法相比,其優點是適用于小量樣品,不用稀釋樣品也不用改變樣品的pH值,尤其適用于對酸、堿不穩定的化合物,特別是待測組分易被某種酶分解時,用超濾可除去該酶,避免欲測物分解。但超濾可能會由于待測組分結合在膜上而影響回收率。
超濾膜的制作材料有醋酸纖維素、聚酰胺、聚砜等,其中醋酸纖維素濾膜最常用。
(5)凝膠色譜法
利用分子大小不同的物質在流過凝膠固定相時的保留時間不同,大分子首先流出,小分子最后流出,可將待測小分子化合物與大分子蛋白質分離。這時待測小分子化合物的濃度被流動相所稀釋,必要時還要進行濃縮后再用色譜分析。
(6)柱色譜法
用能吸附蛋白質的材料裝填成小柱,使欲除蛋白質的樣品流過小柱,樣品中的蛋白質被柱填料吸附,欲測組分不被吸附,從小柱中流出。現已有廠家將這種小柱做成商品出售,稱為預柱。這種預柱可以直接連在HPLC的進樣裝置上,含蛋白質的樣品通過預柱后可直接進入HPLC系統分析。如分析尿中的某些代謝產物時,可將樣品通過預柱,除去蛋白質,直接進入HPLC分析。這種預柱有各種規格,適用于各種不同的目的。