生物物理所揭示一種噬菌體抵抗宿主防御的機制

　　噬菌體是地球上數量最龐大的生物群體，是原核生物的病毒，對維持地球生態系統的有序運行意義重大。在噬菌體和宿主漫長的競賽中，為抵御噬菌體的入侵，原核生物進化出多種系統進行防御，如限制修飾系統、CRISPR-Cas系統以及近來不斷涌現的多種引起流產感染的系統等。其中，CRISPR-Cas系統是已知的唯一一種適應性免疫系統。相應地，噬菌體進化出anti-CRISPR蛋白抑制Cas蛋白的切割，從而保持自身基因組完整。

　　在已知的兩大類六種類型CRISPR-Cas系統里，第二大類II型的Cas9效應蛋白已被廣泛應用于基因編輯，具有簡單、高效的優勢。針對Cas9的anti-CRISPR蛋白不斷被鑒定。對于anti-CRISPR抑制機理的闡釋，不僅可以增進人們對噬菌體與宿主間相互競爭關系的理解，而且有助于后續基因編輯工具的開發。

　　7月26日，中國科學院生物物理研究所王艷麗團隊在《美國國家科學院院刊》（PNAS）上，在線發表了題為AcrIIC4 inhibits type II-C Cas9 by preventing R-loop formation的研究論文，揭示了噬菌體anti-CRISPR蛋白AcrIIC4抑制宿主Cas9監測復合物切割雙鏈DNA活性的分子機制。

　　AcrIIC4由副流感嗜血桿菌的前噬菌體編碼，對II-C型Cas9具有廣譜抑制活性。體外和體內實驗均表明，AcrIIC4在基因編輯過程中能高效抑制Cas9的活性，具有被開發為基因編輯調控工具的潛力。然而，由于缺乏AcrIIC4和Cas9復合物的結構，AcrIIC4發揮抑制的精確機制尚不明確，以及其能否阻止DNA結合方面存在爭議。

　　該研究解析了Cas9、向導RNA（sgRNA）、AcrIIC4和靶標DNA之間的一系列結構，發現AcrIIC4結合到Cas9的兩個識別結構域REC1和REC2之間，并與sgRNA建立了廣泛相互作用，可限制住柔性較大的REC2結構域的運動（圖A）。結構比較發現，有AcrIIC4存在時，靶標鏈（TS）和sgRNA只能形成七個堿基的異源雙鏈配對，R-loop的形成被阻止在中間步驟。這與生化實驗證據相印證：AcrIIC4能降低但不完全阻止Cas9與DNA的結合。進一步的實驗證明，AcrIIC4能阻止雙鏈DNA在PAM遠端解鏈（圖B），并對TS-guide RNA結合通道的形成有影響，從而阻止完整R-loop的形成，終止后續別構激活（圖C）。此外，AcrIIC4抑制II-C型Cas9不同同源蛋白的能力差異較大。該研究通過一級序列和三維結構比對，并結合體外切割實驗，證明了sgRNA的第一個莖環長度的不同是導致這種差異的原因。上述研究對在不同Cas9編輯系統中應用AcrIIC4具有指導意義。

　　研究工作得到國家自然科學基金、中國科學院戰略性先導科技專項（B類）和中國科學院青年創新促進會等的支持。生物物理所生物成像中心和科學研究平臺分別為電鏡數據收集和靜態光散射實驗提供了技術支持。