試劑、試劑盒 GTC 抽提緩沖液 稀釋緩沖液 β-巰基乙醇 無 RNase 水 20XSSC 0.5XSSC 1XPBS。
儀器、耗材 親和素-磁珠 (SA-PMP)生物素標記的 oligo(dT) 探針 磁架 75℃ 水浴50 ml 無菌 Corex 離心管 15 ml 螺旋蓋錐形離心管 TissuemizerDM 或其他同類勻漿器 BeckmanJ2-21 離心機或其他類似設備
實驗步驟
一 材料與設備
1) 親和素-磁珠 (SA-PMP)
2)GTC 抽提緩沖液:4moL/I, 異硫氰酸胍，25 mmol/L 檸檬酸鈉，pH:7.1
3) 生物素標記的 oligo(dT) 探針（50pmol/ul)
4) 稀釋緩沖液：6XSSC，lmmol/L Tris-HCl，PH 7.4，lO mmoL/L EDTA，0.25% SDS
5)β-巰基乙醇 (48.7%)
6) 無 RNase 水
7)20XSSC:67.7 g NaCl 和 44.lg 檸檬酸鈉溶于 400 ml 去離子水中，用 NaOH 調 pH 至 7.2, 加水至 500 ml 體積，用 0.1% DEPC 處理過夜，高壓滅菌
8)0.5XSSC: 20XSSC 用無 RNase 水稀釋而成
9)1XPBS
10) 磁架
11)75℃ 水浴
12)50 ml 無菌 Corex 離心管
13)15 ml 螺旋蓋錐形離心管
14)Tissuemizer DM 或其他同類勻漿器
15)BeckmanJ2-21 離心機或其他類似設備
二 操作方法
以重量小于 0.125 的組織中 mRNA 的純化為例, 大量組織和細胞中 mRNA 的純化可參閱相關產品說明書。
1) 從冰箱中取出 GTC 抽提液、生物素標記的 oligo(dT) 探針、無 RNA 酶的水及 0.5XSSC, 平衡至室溫并預熱稀釋液至 70℃
2) 在 50 ml 無菌螺旋蓋錐形離心管屮，首先加入 lml 抽提液（抽提/BME 緩沖液）然后再向其中加人 41ulβ-巰基乙醇 (48.7%)，保證β-巰基乙醇的終濃度為 2%。井將裝有緩沖液的管子稱重并記錄。
3) 盡可能快地取得所需量的組織并放人到裝有抽提/BME 緩沖液的管中，使用小勻漿器髙速勻漿組織至無可見組織塊。如果無勻漿器，則可將組織快速切碎，液氮冷凍，在裝有液氮的研缽中搗碎研磨。將液氮和組織轉移到無菌的 50 ml 螺旋蓋錐形管中，液氮揮發后，立即加人抽提/BME 緩沖液，使之完全混合
4) 將含有組織及抽提/BME 緩沖液的骨子稱重，減去第 2) 步中的管重并計算組織塊的大小。
5) 參考圖 2.1，根椐第 4) 步計算的組織塊大小決定生物素標記的 oligo(dT) 探針用量和親和素-磁珠 (SA-PMP) 用量。
6) 將 2 ml 預熱稀釋緩沖液加到無菌管中，加入 41ulβ-巰基乙醇 (48.7%)，終濃度為 1%。將此溶液加至勻漿液中. 完全混合。再加入第 5 步確定的探針，晃動以充分混合，并在 70°C 溫育 5 min
7) 轉移勻漿液至一清潔無菌的 15 mlCorex 管屮，室溫 12000 g 離心 1Omim
8) 離心時，輕輕晃動使 SA-PMP 完仝懸浮，將所需量的磁珠轉移到一無菌的 50 ml 螺旋蓋錐形管中，將此管放置在磁架上。水平放置磁架至磁珠全部聚集在管的一側。傾斜管子使溶液不流經磁珠表面. 小心倒掉儲存液
9) 用等體積的 0.5XSSC 懸 SA-PMP，用磁架捕捉，按第 8 步倒掉 SSC 溶液。重復洗滌兩次后，將 SA-PMP 重懸在初始體積0.5XSSC 中。
10) 勻漿液離心完成后，小心取出上清，避免吸取沉淀。將已澄清的勻漿液加人含洗滌好的 SAPMP 的管中，翻轉混合
11) 將勻漿液及 SA-PMP 室溫孵育用磁架捕捉 SAPMP 至勻漿液淸澈. 按前述方法小心傾去上清液。用一無菌管收集上清液，放在冰上保存直至能肯定 mRNA 已獲得令人滿意的結合和洗脫
12) 于 lml0.5XSSC 中宙懸磁珠，再轉移到 2 ml 試管中. 用磁架捕獲磁珠，小心傾去 SSC，重復洗滌兩遍。最后一次洗后要盡可能多地去除 SSC 而不攪動 SA-PMP。
13) 用 0.5 mL 無核酶的水洗脫 mRNA，輕振試管重懸 SA?PMP。
14) 用磁架捕捉 SA-PMP，將洗脫的 RNA 轉移到無藺小離心管中。用無菌水重懸磁珠，保存在冰中直至 mRNA 產量和純度被確定。
15) 向洗脫液中加入 0.1 倍體積的 NaAc（用于 cDNA 克隆) 或 KAc(用于體外翻譯) 和 1 倍體積的異丙醇，放置過夜。
16) 于 12000 g 離心 lOmin，用 lml70?% 乙醇重懸 RNA 沉淀 T 再離心
17) 真空干燥沉淀 15 min 用無 RNase 的去離子水溶解沉淀。
注意事項
1)β-巰基乙醇具冇較大毒性，應在通風櫥中配制并配戴合適的防護設備。
2) 洗脫液中可能有殘存磁珠，于 12OOOg 離心 lmin, 上清轉移至一新管中. 不過，殘存的磁珠不會抑制 RNA 使用中所用的大多數常規酶反應并且它們常常有助于沉淀后的沉淀物定位。