實驗材料 載體和細菌菌株PL 表達載體陽性對照質粒
試劑、試劑盒 考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液L-色氨酸SDS 凝膠加樣緩沖液SDS-聚丙烯酰胺凝膠靶基因或 cDNA 片段LB 瓊脂平板LB 培養基M9 基本培養基
儀器、耗材 SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭沸水浴振蕩培養器
實驗步驟
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液
參見附錄 8。
1XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
L-色氨酸（10 mg/ml)
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培養基
LB 瓊脂平板
LB 培養基
根據所用載體在培養基中加入不同的抗生素。
加熱到 65°C 的 LB 培養基
備選，參見步驟 13。
M9 基本培養基
滅菌后補加 0.5%(m/V) 葡葡糖，0.2%(m/V) 酪蛋白酸水解物和所需抗生素，用于色氨酸誘導的表達載體。
離心機和轉頭
SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭
特別配備
沸水浴
設定為 30°C 和 40°C 的振蕩培養器
只有使用λ噬菌體 cI 基因的溫度敏感型等位基因時才需要。
補充試劑
本方案步驟 1 需要第 8 章方案 7 中所列試劑。
本方案步驟 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列試劑。
本方案步驟 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列試劑。
本方案步驟 4 需要第 12 章方案 3 中所列試劑。
載體和細菌菌株
帶有λ噬菌體 cI 基因的 cIts857 等位基因或野生型等位基因的大腸桿菌菌株在 M5219 菌珠中是熱誘導的 clts857 等位基因，在 GI724 菌珠 (ATCC55151cI 基因）中是色氨酸誘導的野生型 cI 基因。
PL 表達載體（如 pHUB,pPLc,pKC30,pASl,pCQV2,pAL-781 和 pTrxFus)
陽性對照質粒（表達已知大小融合蛋白的 PL 表達載體）
方法
含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1.PCR 修飾（第 8 章方案 7) 或限制性內切酶消化分離 DNA 片段，片段 5'端和 3'端帶有與 PL 表達載體對應的限制酶位點。
必要時可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入強的核糖體結合位點。
為確定擴增反應沒有引入錯誤突變，應對 PCR 產物進行序列分析。
2. 靶 cDNA/基因的 DNA 片段與表達載體連接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 連接產物轉化含有 cIts857 等位基因或野生型 cI 基因的大腸桿菌菌株。將轉化體鋪于含相應選擇抗生素的 LB 平板（通常為 50ug/ml 的氨芐青霉素），于 30°C(含有cIts857 等位基因）或 37°C(含有色氨酸誘導的野生型 cI 基因）過夜培養。
空的表達質粒轉化相同的大腸桿菌菌株作陰性對照。
4. 通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插入片段的轉化體（請參見第 12 章方案 3)。
誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體。
5. 通過提髙溫度或加入色氨酸，下調 cI 阻抑蛋白，誘導靶蛋白表達，篩選最佳表達條件。
影響誘導表達的因素請參見方案 1 步驟 8 的注解。
對于溫度誘導系統
a. 對照菌和重組菌分別挑取 1~2 個菌落，接入 1 ml 含所需抗生素的 LB 培養液，30°C 培養過夜。
編碼己知大小蛋白的表達載體作陽性對照。
b. 取 50ul 接入 10 ml 含抗生素的 LB 培養液，在 50 ml 搖瓶中于 30°C 培養至對數中期（A550=0.5?1.0)。
c. 吸出 lml 未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟 6 和 7 所述進行處理。
d. 調整溫度至 40°C, 誘導剩余培養物。繼續步驟 6。
盡管在本書其他章節中采用 42~45°C 滅活λ噬菌體 cIts857 阻抑物，但此處采用40°C 以便減少熱激蛋白的誘導并使細菌能夠繼續生長。
對于色氨酸誘導系統
a. 含空載體和重組表達載體的大腸桿菌（帶有 cI 野生型等位基因）分別挑取 1~2個菌落，接入 1ml 補充 M9 培養液，37°C 培養過夜。
編碼已知大小蛋白的表達載體作陽性對照。
b. 取 50ul 接入 10 ml 補充 M9 培養液，在 50 ml 搖瓶中于 37°C 培養至對數中期(A550=0.5~1.0)。
c. 吸出 1 ml 未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟 6 和 7 所述進行處理。
d. 剩余培養物中加入色氨酸至終濃度 100ug/ml,37°C 繼續培養。
6. 誘導不同時間（如 1、2、4 和 6 h) 后取 1ml 樣品放于微量離心管中，測定A550, 室溫高速離心 1 min。
7. 沉淀懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液，100°C 加熱 3 min, 室溫高速離心lmin，冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
8. 樣品加熱至室溫，取 40ug 或相當于 0.15 OD550 培養物的懸液上樣于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠。
9.8~15V/cm 電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
10. 考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶（見附錄 8)。
未轉化的大腸桿菌細胞和轉化了空載體的細胞，蛋白質帶形應該沒有區別。誘導一定時間的重組菌應有一條與預計大小一致的帶。
大量表達靶蛋白
11. 挑取一個重組大腸桿菌菌落接入 50 ml 含抗生素的 LB 培養液或補充 M9 培養液,
在 250 ml 搖瓶中于 30°C 或 37°C 過夜培養。
12. 取 50 ml 過夜培養物接入 450 ml 含抗生素的 LB 培養液或補充 M9 培養液，在 2L 搖瓶中于 30°C 或 37°C 振蕩培養至對數中期（A550=0.5~1.0), 按步驟 13 或 14 進行誘導。
13. 加入 500 ml 加熱至 65°C 的 13 培養基，誘導帶 cIts857 等位基因的大腸桿菌。40°C培養預試驗確定的最佳時間。或者于室溫以 12000 g(8600r/min Sorvall 轉頭）離心 5 min 收集細胞，沉淀重懸于 500 ml40°C 的LB 培養基，40°C 繼續培養預試驗確定的最佳時間。
14. 加入色氨酸至終濃度100ug/ml, 誘導帶 cI 等位基因的大腸桿菌。37°C 繼續培養預試驗確定的最佳時間。
15. 誘導適當時間后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞，繼續后面的純化方案：
? 如果表達的是 GST 融合蛋白，繼續方案 5
? 如果表達的是麥芽糖結合蛋白融合蛋白，繼續方案 6
? 如果表達產物帶有組氨酸標簽，繼續方案 7